[交流] 流感病毒RNA，反转录 已有2人参与

菜鸟我生物本科学历，今年6月初开始的测定流感病毒HA，NA的序列工作。因之前专门到做此试验的专业部门去学习过，试剂盒都按学习时采购的。我们的大概流程是：病毒总RNA的提取，反转录，cDNA扩增（PCR），电泳鉴定。。。。。。为什么至写到这里，因为只做到这，就遇到问题，无法向下开展了。 问题： 总的问题：没有得到目的条带（HA：1700bp，NA：1400bp） 提取RNA是用试剂盒提取的，有三条亮带，前两条比较亮。 反转录PCR扩增后，得到的片段多为250bp左右的小片段，没得到1700bp啊~ 多次调整退火温度，甚至更换新的引物（学习时，相同毒种可以P出来的引物），都没有得到目的条带。菜鸟我实在分析不出原因~求助大神予以指导啊~~~ 此外，菜鸟还有些问题求助大神们： 问题1：学习时测序所用流感毒种取自于鸡胚尿囊液，现在所测毒种为细胞培养增值的流感病毒，二者在RNA提取的过程中是否应有所不同？ 问题2：≤250bp甚至＜100bp片段的出现大多由什么原因引起？引物二聚体？还是引物特异性不好呢？还是有别的什么原因? 请各位大神不吝指导，拜托了！！！

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