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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于转录组序列需不需要拿去克隆的问题
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帅气的新锅锅

铜虫 (初入文坛)

[求助] 关于转录组序列需不需要拿去克隆的问题 已有1人参与

各位大神：
     刚开始接触分子，很多都不懂，有个问题想请教一下各位，我师兄去年拿我们的实验材料送去测序，测得了转录组数据库，我在通路和功能注释里面找到了跟生长和免疫相关的一些基因序列，设计了引物，想拿去跑RT-PCR，验证不同处理对我们的实验材料的生长基因的表达有没有影响，实验材料定期取样。因为我们的材料在分子这块刚刚开始，以前没人做过相关的实验，我找的序列不是从NCBI里面直接查到的序列，是自己的转录组数据库里面的，内参也是自己库里的找到的β-actin相关的序列，引物是https://www.genscript.com/ssl-bin/app/primer这个网页设计的，试跑PCR之后，目的基因和内参都扩出来了，没有非特异性扩增二聚体之类的东西，只有一个峰，pcr产物也只有一条带，我想问的是，如果用自己库里的相关序列发表论文的话，人家期刊会不会不承认，认为测出来的序列不准确，需不需要拿去克隆，一定要克隆出来才能承认我们的序列是可用的吗？  希望各位大神予以解答。
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帅气的新锅锅

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阿弥陀佛
1楼 2016-07-11 17:42:40
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
帅气的新锅锅: 金币+20, ★★★★★最佳答案 2016-07-18 08:21:46
引用回帖:
6楼: Originally posted by 帅气的新锅锅 at 2016-07-13 19:27:06
我们的数据已经由师兄提交上去了，我现在只是验证一下转录组序列，然后跑定量，看一下该基因的表达量，请我我现在是不是只需要测序就行了？我不需要做功能验证。辛苦了~~...

你这种情况，如果只是看表达量，可以不测序的，直接设计特异引物做荧光定量PCR。
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帅气的新锅锅
7楼2016-07-14 00:34:28
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-07-12 07:31:33
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎发帖交流 2016-07-12 09:43:39
既然扩出来了，且只有一个峰，直接把PCR产物送测序，然后把测序结果和转录组结果比对一下，确定是你要扩的序列，很多期刊要求文章中的序列要有登录号，你可以把你测序验证后序列单另提交到NCBI的genbank数据库。
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帅气的新锅锅
2楼2016-07-11 19:59:59
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帅气的新锅锅

铜虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2016-07-11 19:59:59
既然扩出来了，且只有一个峰，直接把PCR产物送测序，然后把测序结果和转录组结果比对一下，确定是你要扩的序列，很多期刊要求文章中的序列要有登录号，你可以把你测序验证后序列单另提交到NCBI的genbank数据库。

您说的PCR产物是普通pcr的产物是吧，是不是尽量扩全长？我如果把我那一段目的序列上传到NCBI里面是不是就不需要测序了？后续还需不需要功能验证？顺便问一下你知道上传的步骤吗？毕竟我的序列都是比对过的，覆盖度很高。问题有点多。。。希望不要嫌烦。。。
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阿弥陀佛
3楼2016-07-13 10:04:35
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 帅气的新锅锅 at 2016-07-13 10:04:35
您说的PCR产物是普通pcr的产物是吧，是不是尽量扩全长？我如果把我那一段目的序列上传到NCBI里面是不是就不需要测序了？后续还需不需要功能验证？顺便问一下你知道上传的步骤吗？毕竟我的序列都是比对过的，覆盖度 ...

是要尽量扩全长，高通量测序结果一般都是提交原始测序数据，拼接后得到的我不清楚能否单独提交，单独序列提交建议还是自己PCR后测序。如果你要研究基因功能肯定是要功能验证的。关于序列提交，可以先看我以前在小木虫发过的一个用bankit提交序列的帖子。
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帅气的新锅锅
4楼2016-07-13 14:14:20
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