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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR引物设计出现问题，无论怎么p都出不来
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alex4388

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR引物设计出现问题，无论怎么p都出不来 已有1人参与

实验室有人溶菌酶的一段基因，在载体pPIC9K上，溶菌酶序列后面加了两段GGGGS连接肽，后面还有一段多肽序列。

现在想要把多肽换成其他的12肽，可是设计引物的时候由于GGGGS（序列GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCC）的存在，怎么都p不出

也就是BamHI +人溶菌酶+GGGGSGGGGS+12肽+ECoRI的结构

前面的100个碱基

GGATCCAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAAC

尾巴的碱基

CGTTCGTCAATACGTCCAAGGTTGTGGTGTTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCCTCTGGTGTTTACAAGGTTGCTTACGATTGGCAACACTAAGAATTC

求大神帮我设计方案了！！

跪谢！！
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1楼 2016-07-10 11:32:28
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976592787

木虫 (正式写手)

国家自然科学基金委员会委员长
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-07-11 07:01:48
搞这么复杂干嘛，引物设计只要注意酶切位点和保护碱基的问题，连到什么样的载体，信号肽之类另说，只要引物差不多条件，模板上有这段基因pcr就一定p的出来

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耻与众草之为伍，何亭亭而独芳！何不为人之所赏兮，深山穷谷委严霜。
2楼2016-07-10 13:38:19
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alex4388

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 976592787 at 2016-07-10 13:38:19
搞这么复杂干嘛，引物设计只要注意酶切位点和保护碱基的问题，连到什么样的载体，信号肽之类另说，只要引物差不多条件，模板上有这段基因pcr就一定p的出来

由于G4S的存在，引物自身会形成发卡结构，每次测序都是最后几个bp发生了突变（在有效读长范围内）
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3楼2016-07-10 16:31:34
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不爱做实验

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物自身发卡结构可通过提高退货温度得到一定程度解决
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4楼2016-07-11 13:47:49
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