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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒酶切
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shigm1121

新虫 (初入文坛)

[求助] 质粒酶切 已有3人参与

各位学友：我再用Kpn1和Sac1酶切我构建的载体pBI121—GFP,没有切到我的目标基因GFP，在此求助。
我用的体系是40μl
建立如下双酶切反应体系:
dH2O  14μl
10XL  buffer  4μl
质粒DNA      20μl
Kpn1       1μl
Sac1       1μl
(2)37℃保温  5h
(3)65℃保温   10  min灭活限制酶"
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1楼 2016-07-10 11:25:40
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18716248350

新虫 (小有名气)
首先考虑重组载体上是否9436

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2楼2016-07-10 17:28:39
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18716248350

新虫 (小有名气)
还没写完，发错了，7486

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3楼2016-07-10 17:29:00
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18716248350

新虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-07-11 06:59:11
哎呀，实在不好意思，这手机出问题了，首先考虑重组载体上是否连上了GFP，然后两个酶公用buffer有没选对，酶有没有过期，你质粒浓度多大的加了20ul，一般1ul酶切1ug质粒，然后过夜酶切效果会较好，如果要回收可以先用20ul小体系切开了再加大体积做回收

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4楼2016-07-10 17:33:01
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奋斗的勤快虫

新虫 (初入文坛)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
5楼2016-07-11 00:27:01
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
质粒浓度有多少？两个限制酶是否在网上匹配过最适的buffer？

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6楼2016-07-11 00:52:15
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不爱做实验

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shigm1121: 金币+5, 酶切时间我给搞了5个小时 2016-07-12 08:33:36
1、酶、buffer是否合适
2、一般酶切2-3h足够，酶切太久会切散或者看不到目的条带
3、质粒的提取质量如何？
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7楼2016-07-11 10:28:47
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
选一个GFP基因上的酶切位点，选一个载体上的位点，双酶切，看看是否有目的带
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8楼2016-07-11 17:02:37
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shigm1121

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 18716248350 at 2016-07-10 17:33:01
哎呀，实在不好意思，这手机出问题了，首先考虑重组载体上是否连上了GFP，然后两个酶公用buffer有没选对，酶有没有过期，你质粒浓度多大的加了20ul，一般1ul酶切1ug质粒，然后过夜酶切效果会较好，如果要回收可以先 ...

亲：请问“用20ul小体系切开了再加大体积做回收”这个怎么做啊
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9楼2016-07-12 08:12:41
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18716248350

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by shigm1121 at 2016-07-12 08:12:41
亲：请问“用20ul小体系切开了再加大体积做回收”这个怎么做啊...

就是先做一管20ul体系的把酶切体系时间这些条件摸好，然后同时做5管酶切，纯化或者胶回收时全部吸附到一个柱子上。

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10楼2016-07-12 09:33:54
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