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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 原核表达想做SDS PAGE怎么处理样品
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

[求助] 原核表达想做SDS PAGE怎么处理样品 已有2人参与

用的是pGEX.载体，菌液想做SDS PAGE应该如何处理样品呀？

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1楼 2016-07-10 11:08:28
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
顶

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2楼2016-07-10 12:40:01
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎发帖交流 2016-07-11 07:04:28
是大肠杆菌么？一般简单检测直接菌体煮沸即可用于上样，也可以超声破碎后，将上清沉淀都检测，看看目的蛋白表达情况。

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
3楼2016-07-10 20:54:50
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-07-10 20:54:50
是大肠杆菌么？一般简单检测直接菌体煮沸即可用于上样，也可以超声破碎后，将上清沉淀都检测，看看目的蛋白表达情况。

需要既超声又煮沸吗？
超声频率和时间是多少呀？
是在沉淀中加水然后加SDS上样缓冲液，然后煮沸吗？

需要用到细菌裂解液吗？

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4楼2016-07-10 21:21:53
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

xn8008: 应助指数+1 2016-07-11 07:04:40
引用回帖:
4楼: Originally posted by yuguiyan at 2016-07-10 21:21:53
需要既超声又煮沸吗？
超声频率和时间是多少呀？
是在沉淀中加水然后加SDS上样缓冲液，然后煮沸吗？
需要用到细菌裂解液吗？
...

如果是大肠杆菌的话，就是你收集菌体，用PBS缓冲液重悬一下，一般2mM ph7.0 PBS就可以，实在没有用水也可以，重悬一般是比原有菌液浓缩十倍左右吧，具体超声参数我记不得了，不同意思效果不一，不过大肠还是很好破碎的，不需要额外加裂解液，破碎完以后，离心将上清沉淀分离。沉淀用和上清等体积的PBS重悬，然后取一些加loading buffer进行检测，看你的目的蛋白是在上清还是包涵体内，祝好。

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5楼2016-07-10 21:49:06
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-07-10 21:49:06
如果是大肠杆菌的话，就是你收集菌体，用PBS缓冲液重悬一下，一般2mM ph7.0 PBS就可以，实在没有用水也可以，重悬一般是比原有菌液浓缩十倍左右吧，具体超声参数我记不得了，不同意思效果不一，不过大肠还是很好破 ...

上清也加PBS吗

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6楼2016-07-10 22:01:56
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by yuguiyan at 2016-07-10 22:01:56
上清也加PBS吗
...

上清本身就是PBS的呀，你超声前重悬菌体用的PBS，超声完离心上清不还是PBS么

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7楼2016-07-10 22:11:12
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-07-10 22:11:12
上清本身就是PBS的呀，你超声前重悬菌体用的PBS，超声完离心上清不还是PBS么
...

如果既煮沸又超声，有先后顺序吗？

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8楼2016-07-10 22:18:44
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by yuguiyan at 2016-07-10 22:18:44
如果既煮沸又超声，有先后顺序吗？
...

额，超声完你制备好样品，是要煮沸一下才可以上样的

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9楼2016-07-10 22:25:14
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-07-10 22:25:14
额，超声完你制备好样品，是要煮沸一下才可以上样的
...

好的，多谢你啦

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10楼2016-07-10 22:25:40
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