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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【TA克隆测序】挑选克隆子的个数
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llddfxy

新虫 (初入文坛)

[求助] 【TA克隆测序】挑选克隆子的个数 已有1人参与

分子生物新手，PCR出了某抗性基因目的条带，想送去做TA克隆测序确认一下是不是真的是目的序列，想请问一下像我这种情况一般需要挑选多少个克隆子测序呢？基因公司建议我选10个，怎么感觉有点多啊...
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1楼 2016-07-07 22:03:09
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clark2010

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-07-09 08:20:18
你的DNA样本是从哪里提取的？如果是提取的纯菌DNA，送1个就够了，不放心就多送1个。如果是环境样品的总DNA，10个都觉得少。
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2楼2016-07-08 05:10:00
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llddfxy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by clark2010 at 2016-07-08 05:10:00
你的DNA样本是从哪里提取的？如果是提取的纯菌DNA，送1个就够了，不放心就多送1个。如果是环境样品的总DNA，10个都觉得少。

我提的是环境样品的总DNA，目的片段是该抗性基因中的一段一百多bp的片段。是因为不同的菌表达该抗性的基因序列会不一样，所以才要多测吗？可是我之前用引物blast出来的别人的结果目的基因序列都一样啊。我还是不太懂，求指教

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3楼2016-07-08 09:14:59
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clark2010

金虫 (小有名气)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-07-09 08:20:46
引用回帖:
3楼: Originally posted by llddfxy at 2016-07-08 09:14:59
我提的是环境样品的总DNA，目的片段是该抗性基因中的一段一百多bp的片段。是因为不同的菌表达该抗性的基因序列会不一样，所以才要多测吗？可是我之前用引物blast出来的别人的结果目的基因序列都一样啊。我还是不太 ...

你说的对，不同的菌，抗性基因序列会有差异，所以要多测，反映其多样性。
但是，100 bp的话，有点短，差异可能不是很大。如果这一段的多样性比较高，那还好；如果你正好是在保守区，那测序结果就几乎一样，也就没法做多样性了。你blast出来的结果，目的基因序列都一样，我个人觉得这段序列是比较保守的，属于后一种情况，接着做下去，没多大意义。
当然，以上只是基于你的实验目的是分析该抗性基因在环境中的多样性而言的。

如果你只是为了验证环境中是否有该基因，那么，送1-3个去测序，在blast证明你的PCR结果确实是P到了该目的基因，不是假阳性，那就可以了。
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4楼2016-07-08 16:31:52
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llddfxy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by clark2010 at 2016-07-08 16:31:52
你说的对，不同的菌，抗性基因序列会有差异，所以要多测，反映其多样性。
但是，100 bp的话，有点短，差异可能不是很大。如果这一段的多样性比较高，那还好；如果你正好是在保守区，那测序结果就几乎一样，也就没 ...

明白了，太感谢了。

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5楼2016-07-08 21:29:32
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