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啄木鸟HXH

新虫 (初入文坛)

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[求助] pet-32a做原核表达，空质粒转化DH5a一直无阳性克隆出现，求原因已有4人参与

借的pet-32a质粒载体，浓度为34微克每毫升，因为浓度较低，需要先用空质粒转化DH5a,摇菌后大提，用浓度高的质粒载体做酶切连接。
但是，空质粒转DH5a涂板（氨苄抗性）,第二天总是筛选不到阳性菌落。楼主试着从以下分析原因：
1.感受态细胞问题，因为感受态细胞是自己做的，心里十分没底，但是用诺维赞的DH5a.也不出现阳性菌落
2.载体存放时间过久浓度降低。
3、个人操作问题，楼主感觉都是按着标准操作程序走的，怎么就不出结果呢？
各位同仁有遇到相似情况没，望指点一二，不胜感激

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1楼 2016-06-26 00:17:13

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原海亮

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【答案】应助回帖

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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-06-26 10:14:54

质粒做转化应该是非常容易的，而且对质粒浓度要求也不高，你说晒不到阳性克隆是什么个情况呢？是没有菌落生长，还是有菌落生长但是里面没有质粒？如果是没有菌落生长，首先看平板抗性有没有用错，其次，就是操作问题，最后质粒跑个胶，上样两三微升，看看肉眼能不能看到条带。如果有菌落生长，但里面没有质粒，那么你应该考虑你的感受态是否有污染，为何没有质粒进入也可以在抗性平板生长？转化时拿一管感受态做对照。另外你判断为假阳性的放法是什么，菌液pcr？提质粒？还是怎样……，这些筛选方法也容易出问题。当然你既然可以要到质粒，还不如直接找别人借一株含有质粒的菌呢，哈哈，祝好！

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