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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pet-32a做原核表达，空质粒转化DH5a一直无阳性克隆出现，求原因
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啄木鸟HXH

新虫 (初入文坛)

[求助] pet-32a做原核表达，空质粒转化DH5a一直无阳性克隆出现，求原因 已有4人参与

借的pet-32a质粒载体，浓度为34微克每毫升，因为浓度较低，需要先用空质粒转化DH5a,摇菌后大提，用浓度高的质粒载体做酶切连接。
但是，空质粒转DH5a涂板（氨苄抗性）,第二天总是筛选不到阳性菌落。楼主试着从以下分析原因：
1.感受态细胞问题，因为感受态细胞是自己做的，心里十分没底，但是用诺维赞的DH5a.也不出现阳性菌落
2.载体存放时间过久浓度降低。
3、个人操作问题，楼主感觉都是按着标准操作程序走的，怎么就不出结果呢？
各位同仁有遇到相似情况没，望指点一二，不胜感激
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1楼 2016-06-26 00:17:13
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-06-26 10:14:54
质粒做转化应该是非常容易的，而且对质粒浓度要求也不高，你说晒不到阳性克隆是什么个情况呢？是没有菌落生长，还是有菌落生长但是里面没有质粒？如果是没有菌落生长，首先看平板抗性有没有用错，其次，就是操作问题，最后质粒跑个胶，上样两三微升，看看肉眼能不能看到条带。如果有菌落生长，但里面没有质粒，那么你应该考虑你的感受态是否有污染，为何没有质粒进入也可以在抗性平板生长？转化时拿一管感受态做对照。另外你判断为假阳性的放法是什么，菌液pcr？提质粒？还是怎样……，这些筛选方法也容易出问题。当然你既然可以要到质粒，还不如直接找别人借一株含有质粒的菌呢，哈哈，祝好！

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
5楼2016-06-26 07:42:10
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妞—潇洒

新虫 (正式写手)
质粒载体酶切结果好的话 载体就没问题 感受态可以买北京全式金的trans 蛮好用的 还有就是注意连接的环境以及带氨苄抗性的平板

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我只管面朝大海，龇牙咧嘴，至于花爱开不开
10楼2016-06-27 16:19:54
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普通回帖

夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 应助指数+1 2016-06-26 06:43:06
操作的可能性比较大，载体的浓度不算太小。
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2楼2016-06-26 01:12:20
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ttszero

新虫 (小有名气)
实在不行，直接从公司买不行么？这种常用载体也不算贵啊……空载

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3楼2016-06-26 01:12:25
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ttszero

新虫 (小有名气)
空载很好转dh5a的，虽然浓度还行，跑个gel看看plasmid状态比测浓度好

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4楼2016-06-26 01:14:25
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kungfu2016

新虫 (正式写手)
质粒有问题

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6楼2016-06-27 12:56:36
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viki_MDK

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
抗性 有没有加对，抗性对，，质粒转化肯定没问题的
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7楼2016-06-27 15:51:01
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rodickholm

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.感受态有问题
2.转化有问题
3.质粒有问题
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8楼2016-06-27 15:55:40
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
1.感受态原因

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9楼2016-06-27 16:19:32
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