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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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啄木鸟HXH

超级版主

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[求助] pet-32a做原核表达,空质粒转化DH5a一直无阳性克隆出现,求原因 已有4人参与

借的pet-32a质粒载体,浓度为34微克每毫升,因为浓度较低,需要先用空质粒转化DH5a,摇菌后大提,用浓度高的质粒载体做酶切连接。
但是,空质粒转DH5a涂板(氨苄抗性),第二天总是筛选不到阳性菌落。楼主试着从以下分析原因:
1.感受态细胞问题,因为感受态细胞是自己做的,心里十分没底,但是用诺维赞的DH5a.也不出现阳性菌落
2.载体存放时间过久浓度降低。
3、个人操作问题,楼主感觉都是按着标准操作程序走的,怎么就不出结果呢?
各位同仁有遇到相似情况没,望指点一二,不胜感激
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原海亮

版主

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-06-26 10:14:54
质粒做转化应该是非常容易的,而且对质粒浓度要求也不高,你说晒不到阳性克隆是什么个情况呢?是没有菌落生长,还是有菌落生长但是里面没有质粒?如果是没有菌落生长,首先看平板抗性有没有用错,其次,就是操作问题,最后质粒跑个胶,上样两三微升,看看肉眼能不能看到条带。如果有菌落生长,但里面没有质粒,那么你应该考虑你的感受态是否有污染,为何没有质粒进入也可以在抗性平板生长?转化时拿一管感受态做对照。另外你判断为假阳性的放法是什么,菌液pcr?提质粒?还是怎样……,这些筛选方法也容易出问题。当然你既然可以要到质粒,还不如直接找别人借一株含有质粒的菌呢,哈哈,祝好!

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天空才是极限,我有信心飞的更高!
5楼2016-06-26 07:42:10
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妞—潇洒

超级版主

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质粒载体酶切结果好的话 载体就没问题 感受态可以买北京全式金的trans 蛮好用的 还有就是注意连接的环境以及带氨苄抗性的平板

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我只管面朝大海,龇牙咧嘴,至于花爱开不开
10楼2016-06-27 16:19:54
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普通回帖

夏天的普洱茶

超级版主

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【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 应助指数+1 2016-06-26 06:43:06
操作的可能性比较大,载体的浓度不算太小。
2楼2016-06-26 01:12:20
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ttszero

管理员

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实在不行,直接从公司买不行么?这种常用载体也不算贵啊……空载

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3楼2016-06-26 01:12:25
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ttszero

专家顾问

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空载很好转dh5a的,虽然浓度还行,跑个gel看看plasmid状态比测浓度好

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4楼2016-06-26 01:14:25
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kungfu2016

实习版主

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6楼2016-06-27 12:56:36
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viki_MDK

主管区长

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【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
抗性 有没有加对,抗性对,,质粒转化肯定没问题的
7楼2016-06-27 15:51:01
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rodickholm

专家顾问

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【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1.感受态有问题
2.转化有问题
3.质粒有问题
8楼2016-06-27 15:55:40
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aofeng860308

主管区长

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9楼2016-06-27 16:19:32
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