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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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didibisheng

新虫 (小有名气)


[求助] 融合基因插入到载体里如何判断正反向 已有5人参与

有一段通过重叠PCR得到的融合基因片段插入到一个载体里,分析只能做单酶切(用Xcm1),连接后做菌落PCR,采用什么方法可以判断该融合基因插入的正反向呢?有在网上查到菌P的引物可以用载体的正向引物和融合基因的正向引物,得到的是反向插入;载体的正向引物和融合基因的反向引物,得到的是正向插入。按照这个说法,送测得到的结果却不对,求各位大神相助!
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 支持积极回帖 2016-06-13 08:33:33
最好用酶切,在片段里选一个单一酶切位点,载体上选个位点,双酶切,根据释放条带大小判断方向。但是要注意,绝对不能选这样的酶切位点:无论插正了还是反了得到的片段大小都一样的。
4楼2016-06-12 21:51:33
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎积极回帖,并提供有意义的信息 2016-06-15 10:19:11
用载体的通用引物测序,根据测序结果不就能直接判断出插入方向了吗。
5楼2016-06-13 00:34:53
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普通回帖

zhao强

银虫 (小有名气)

做科研,用心
2楼2016-06-12 17:24:11
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kaobo2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
一般都是用载体的正向、反向引物吧?
3楼2016-06-12 21:32:44
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gastrodia

金虫 (正式写手)

设计一对引物,跨片段和载体,做PCR即可判断方向

发自小木虫Android客户端
6楼2016-06-13 07:18:41
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我爱chi辣椒

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 不错的建议,欢迎回帖 2016-06-15 10:20:41
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 不错的建议,欢迎回帖 2016-06-15 10:21:02
载体序列未知吗?如果有载体序列就在载体上和目的基因设计引物,P出来后直接测序。如果P不出来,说明已经反了,前提是载体引物要特异。

发自小木虫IOS客户端
A right way maybe not a good way!
7楼2016-06-13 13:00:22
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didibisheng

新虫 (小有名气)


引用回帖:
4楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2016-06-12 21:51:33
最好用酶切,在片段里选一个单一酶切位点,载体上选个位点,双酶切,根据释放条带大小判断方向。但是要注意,绝对不能选这样的酶切位点:无论插正了还是反了得到的片段大小都一样的。

老师也是让酶切鉴定,不过用菌P会快一些吧!
8楼2016-06-13 18:59:08
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didibisheng

新虫 (小有名气)


引用回帖:
7楼: Originally posted by 我爱chi辣椒 at 2016-06-13 13:00:22
载体序列未知吗?如果有载体序列就在载体上和目的基因设计引物,P出来后直接测序。如果P不出来,说明已经反了,前提是载体引物要特异。

载体序列已知,酱紫的情况,我需要这段融合序列反向插入到载体里,就按照载体和融合基因的正向引物进行菌P,然后将P出来的送测,不过得到的测序结果这段序列是正向插入的,就不对了嘛,很苦恼不知道怎么办。
9楼2016-06-13 20:05:43
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didibisheng

新虫 (小有名气)


引用回帖:
6楼: Originally posted by gastrodia at 2016-06-13 07:18:41
设计一对引物,跨片段和载体,做PCR即可判断方向

怎么设计引物啊,我是需要这段融合序列反向插入到载体里~
10楼2016-06-13 20:07:13
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