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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 融合基因插入到载体里如何判断正反向
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didibisheng

新虫 (小有名气)

[求助] 融合基因插入到载体里如何判断正反向 已有5人参与

有一段通过重叠PCR得到的融合基因片段插入到一个载体里，分析只能做单酶切（用Xcm1），连接后做菌落PCR，采用什么方法可以判断该融合基因插入的正反向呢？有在网上查到菌P的引物可以用载体的正向引物和融合基因的正向引物，得到的是反向插入；载体的正向引物和融合基因的反向引物，得到的是正向插入。按照这个说法，送测得到的结果却不对，求各位大神相助！
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1楼 2016-06-12 17:07:59
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 支持积极回帖 2016-06-13 08:33:33
最好用酶切，在片段里选一个单一酶切位点，载体上选个位点，双酶切，根据释放条带大小判断方向。但是要注意，绝对不能选这样的酶切位点：无论插正了还是反了得到的片段大小都一样的。
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4楼2016-06-12 21:51:33
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎积极回帖，并提供有意义的信息 2016-06-15 10:19:11
用载体的通用引物测序，根据测序结果不就能直接判断出插入方向了吗。
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5楼2016-06-13 00:34:53
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普通回帖

zhao强

银虫 (小有名气)
可以找老师问一下

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做科研，用心
2楼2016-06-12 17:24:11
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kaobo2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般都是用载体的正向、反向引物吧？
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3楼2016-06-12 21:32:44
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gastrodia

金虫 (正式写手)
设计一对引物，跨片段和载体，做PCR即可判断方向

发自小木虫Android客户端
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6楼2016-06-13 07:18:41
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我爱chi辣椒

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 不错的建议，欢迎回帖 2016-06-15 10:20:41
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 不错的建议，欢迎回帖 2016-06-15 10:21:02
载体序列未知吗？如果有载体序列就在载体上和目的基因设计引物，P出来后直接测序。如果P不出来，说明已经反了，前提是载体引物要特异。

发自小木虫IOS客户端
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A right way maybe not a good way！
7楼2016-06-13 13:00:22
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didibisheng

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2016-06-12 21:51:33
最好用酶切，在片段里选一个单一酶切位点，载体上选个位点，双酶切，根据释放条带大小判断方向。但是要注意，绝对不能选这样的酶切位点：无论插正了还是反了得到的片段大小都一样的。

老师也是让酶切鉴定，不过用菌P会快一些吧！
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8楼2016-06-13 18:59:08
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didibisheng

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 我爱chi辣椒 at 2016-06-13 13:00:22
载体序列未知吗？如果有载体序列就在载体上和目的基因设计引物，P出来后直接测序。如果P不出来，说明已经反了，前提是载体引物要特异。

载体序列已知，酱紫的情况，我需要这段融合序列反向插入到载体里，就按照载体和融合基因的正向引物进行菌P，然后将P出来的送测，不过得到的测序结果这段序列是正向插入的，就不对了嘛，很苦恼不知道怎么办。
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9楼2016-06-13 20:05:43
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didibisheng

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gastrodia at 2016-06-13 07:18:41
设计一对引物，跨片段和载体，做PCR即可判断方向

怎么设计引物啊，我是需要这段融合序列反向插入到载体里~
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10楼2016-06-13 20:07:13
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