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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 重叠延pcr总是出现很亮的杂带，求大神指教
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wbb645

木虫 (小有名气)

[求助] 重叠延pcr总是出现很亮的杂带，求大神指教 已有1人参与

最近做重叠PCR，两个需重叠的基因分别为启动子1200bp，终止子800bp，linker为30bp，酶用的是2×Taq  Master Mix，反应条件如下：
反应条件如下：
第一轮10个循环
94℃×5min
94℃×30s
50℃×30s
72℃×2min30s
72℃×10min
第二轮30个循环
94℃×5min
94℃×30s
56℃×30s
72℃×2min30s
72℃×10min
体系为50微升：Taq  Master Mix 25微升、启动子1微升、终止子0.5微升、双蒸水21.5微升、上游引物1微升、下游引物1微升（由于终止子条带比启动子的亮的多，所以启动子加的多）
marker分别是8000，5000,3000,2000,1000、750、500、250、100bp
实验结果：总会出现800bp左右的杂带，导致无法胶回收，求教大神指点

重叠延pcr总是出现很亮的杂带，求大神指教
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1楼 2016-06-12 11:13:15
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xiedaim

新虫 (小有名气)
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wbb645
9楼2016-06-14 09:44:42
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jiuzi59

铁杆木虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-06-15 22:52:58
楼主范了一个致命的错误，mix第一轮会出现带A的尾巴，所以重叠PCR第一轮不能用mix，只能用扩增为平端的高保真酶。

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wbb645
10楼2016-06-15 06:07:19
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普通回帖

Mier

新虫 (初入文坛)
★
wbb645(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰·手有余香，谢谢你的理解与支持。myprayer祝您科研顺利，文章多多。 2016-06-12 17:45:23
为什么 跑开来 紫外下切胶 回收 很简单啊

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wbb645
2楼2016-06-12 11:41:21
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选择远方523

新虫 (初入文坛)
你切下来测序好了，重叠pcr很容易出杂带的

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wbb645
3楼2016-06-12 14:23:47
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wbb645

木虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by Mier at 2016-06-12 11:41:21
为什么 跑开来 紫外下切胶 回收 很简单啊

做过一次大孔胶回收时，杂带和目的条带离的很近，回收之后出现了杂带
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4楼2016-06-12 15:05:50
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wbb645

木虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 选择远方523 at 2016-06-12 14:23:47
你切下来测序好了，重叠pcr很容易出杂带的

我需要将目的条带回收，后面做双酶切，关键是怎么除去杂带呢
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5楼2016-06-12 15:07:58
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草溪河

铁虫 (著名写手)
★
xn8008: 金币+1, 说的很中肯 2016-06-13 08:25:19
切胶吧，采用合适的琼脂糖浓度和增加胶的长度，应该可以分开的。切的时候，切薄些，宁少也勿贪多

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wbb645
6楼2016-06-12 22:40:39
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选择远方523

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wbb645 at 2016-06-12 15:07:58
我需要将目的条带回收，后面做双酶切，关键是怎么除去杂带呢...

把你需要的条带切胶回收啊

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7楼2016-06-12 22:42:20
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dingjienky

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
重叠PCR都这样你跑来了切胶回收就好了，你用的什么marker？

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8楼2016-06-13 23:29:18
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