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wbb645木虫 (小有名气)
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[求助]
重叠延pcr总是出现很亮的杂带，求大神指教 已有1人参与
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最近做重叠PCR，两个需重叠的基因分别为启动子1200bp，终止子800bp，linker为30bp，酶用的是2×Taq Master Mix，反应条件如下： 反应条件如下： 第一轮10个循环 94℃×5min 94℃×30s 50℃×30s 72℃×2min30s 72℃×10min 第二轮30个循环 94℃×5min 94℃×30s 56℃×30s 72℃×2min30s 72℃×10min 体系为50微升：Taq Master Mix 25微升、启动子1微升、终止子0.5微升、双蒸水21.5微升、上游引物1微升、下游引物1微升（由于终止子条带比启动子的亮的多，所以启动子加的多） marker分别是8000，5000,3000,2000,1000、750、500、250、100bp 实验结果：总会出现800bp左右的杂带，导致无法胶回收，求教大神指点  FAJ2}(_A~7F`_NDZT(M1KHX.png |
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）
wbb6459楼2016-06-14 09:44:42
jiuzi59
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-06-15 22:52:58
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楼主范了一个致命的错误，mix第一轮会出现带A的尾巴，所以重叠PCR第一轮不能用mix，只能用扩增为平端的高保真酶。 发自小木虫Android客户端 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
10楼2016-06-15 06:07:19
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wbb645(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰·手有余香，谢谢你的理解与支持。myprayer祝您科研顺利，文章多多。 2016-06-12 17:45:23
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为什么 跑开来 紫外下切胶 回收 很简单啊 发自小木虫IOS客户端 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
2楼2016-06-12 11:41:21
3楼2016-06-12 14:23:47
wbb645
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4楼2016-06-12 15:05:50
wbb645
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5楼2016-06-12 15:07:58
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xn8008: 金币+1, 说的很中肯 2016-06-13 08:25:19
xn8008: 金币+1, 说的很中肯 2016-06-13 08:25:19
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切胶吧，采用合适的琼脂糖浓度和增加胶的长度，应该可以分开的。切的时候，切薄些，宁少也勿贪多 发自小木虫Android客户端 |
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6楼2016-06-12 22:40:39
7楼2016-06-12 22:42:20
8楼2016-06-13 23:29:18
