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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 怎么鉴定crispr/cas9单敲和双敲小鼠
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西大慢慢

铁虫 (著名写手)

[求助] 怎么鉴定crispr/cas9单敲和双敲小鼠 已有1人参与

各位大神，我想请教一个问题，我目前通过crispr/cas9系统敲除了小鼠某个基因，通过PCR获得了该基因的片段，通过测序发现敲除的片段只有20bp,因此不能通过凝胶电泳分离目的基因鉴定小鼠属于野生，单敲，双敲（如果敲除的片段足够大，通过凝胶电泳可以发现，双敲的片段小跑的距离远，野生的片段大跑的慢，单敲的会出现两条带从而鉴别开来）。但通过测序我们可以鉴定出野生型以及单敲、双敲，而不能区分双敲和单敲，因为它们的测序结果在敲除片段的峰都是杂峰。因而，我们将PCR产物通过TA克隆然后转入大肠杆菌中培养，然后随机的挑选菌落，每个菌落培养后，再测序，并且与该基因序列对比，如果有一条序列不完整为单敲，两条不完整为双敲。然后我的问题是，通过TA克隆的载体转入大肠杆菌后，连接不同的基因型载体的大肠杆菌是分布在不同的菌落吗？或者换句话说，将不同大小的基因片段克隆在同一种质粒载体转化进入大肠杆菌，在同一个培养皿中培养，它们会分布在不同的菌落上吗？或者你们是怎样鉴定这种小鼠基因型的

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1楼 2016-06-11 23:57:09
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とうあらわ

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 西大慢慢 at 2016-06-13 07:24:16
双敲就是同一基因在两条染色体上都敲除了

用酶切的方法可以吗？讲靶位点上下的一小段序列扩增出来，因为片段小，然后搜寻只在靶位点工作的酶切酶，酶切后，敲出的应该不会发生酶切的。所以如果单敲的应该有三条带，双敲的只有一条带。你觉得可以吗？

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10楼2016-06-15 21:23:57
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armigera

金虫 (正式写手)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰·手有余香，谢谢你的理解与支持。祝您科研顺利，文章多多。 2016-06-12 19:38:46
每个菌落都是由一种菌生长起来的，而每个菌里面的质粒在你能看到菌落的时候都是单一的（因为有质粒不兼容性），所以你这个方法理论上是可以的。可能会遇到不同大小质粒分布数量不同，但你这是定性实验，多挑几个就能解决。

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西大慢慢
2楼2016-06-12 09:00:28
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armigera

金虫 (正式写手)
我们原来是在这20bp的区域设计引物，如果不能pcr出来说明双敲，p出来量少为单敲，量多为野生

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3楼2016-06-12 09:03:15
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西大慢慢

铁虫 (著名写手)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by armigera at 2016-06-12 09:00:28
每个菌落都是由一种菌生长起来的，而每个菌里面的质粒在你能看到菌落的时候都是单一的（因为有质粒不兼容性），所以你这个方法理论上是可以的。可能会遇到不同大小质粒分布数量不同，但你这是定性实验，多挑几个就能 ...

谢谢，我再问一问可不可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将片段为20bp差异的分开，如果可以的话就可以不用测序了

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4楼2016-06-12 10:36:38
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