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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 上样量对树脂纯化蛋白的影响
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zy晨曦

新虫 (小有名气)

[求助] 上样量对树脂纯化蛋白的影响 已有2人参与

首次使用弱阴离子交换树脂纯化蛋白，第一次上柱70%的吸附量后洗脱，低浓度盐可以洗脱出来蛋白，第二次上样量减少到50%左右上柱后洗脱，增加盐浓度才能洗脱蛋白，这是为何。第一次上样前树脂再生是利用1M氯化钠，第二次上样前再生是利用碱-盐再生。并且有个问题，弱阴离子交换树脂的Ph如何调整到合适的ph，现在我都是倒出来调好ph然后装柱，有个朋友说不用调整ph。
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日事日毕，日清日高
1楼 2016-06-05 15:03:12
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你说的应该是DEAE Sepharose FF 介质，什么PH要看你的目标酶的稳定性，最高活性PH，PI等，要大于你目标酶的PI一个单位至少。层析过程：平衡，上样，清洗，洗脱，不存在换PH的说法，换也是换平衡缓冲液的PH，直接用新的缓冲液平衡就好，不用倒出来。

上柱70%还是50%的吸附量你如何确定的。上样量越多残留在介质缓冲体积重的没吸附的蛋白越多，所以低盐能洗出来，上样量小，缓冲体系残留的蛋白越少，所以要增加盐浓度洗脱出吸附量弱的蛋白。祝顺利。
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2楼2016-06-07 10:42:21
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zy晨曦

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hc-material at 2016-06-07 10:42:21
你说的应该是DEAE Sepharose FF 介质，什么PH要看你的目标酶的稳定性，最高活性PH，PI等，要大于你目标酶的PI一个单位至少。层析过程：平衡，上样，清洗，洗脱，不存在换PH的说法，换也是换平衡缓冲液的PH，直接用新 ...

谢谢您的回复，首先ph问题是因为树脂在洗脱过程中或是放置一天后流出液的ph升高，由原先的7.5上升至8.0，所以再次使用时我都会将ph调到7.5.利用0.025的磷酸盐缓冲液要冲洗很长时间，所以就将树脂倒出调ph。
上样量是随意改变的，上样量是树脂最大吸附量的70%和50%，因为第一次使用最大吸附量的70%上样，出现了0.05M的氯化钠洗脱出目的蛋白（以前从没有洗脱出来，估计和上样量或是树脂使用次数过多导致某些目的蛋白吸附力弱有关），0.2M也能洗脱。所以降低上样量为最大吸附的50%。但是0.4M的氯化钠（以前是0.2M氯化钠）才能洗脱出目的蛋白。这两次的蛋白纯化实验和以前的都有不同之处。
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日事日毕，日清日高
3楼2016-06-11 20:32:06
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walking dead

金虫 (小有名气)

填料制备和蛋白纯化专家

【答案】应助回帖

弱阴离子交换介质，你要调换PH值，不用倒出来，你直接用你需要的PH缓冲液平衡8~10倍柱体积。

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4楼2016-06-15 17:12:54
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zy晨曦

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by walking dead at 2016-06-15 17:12:54
弱阴离子交换介质，你要调换PH值，不用倒出来，你直接用你需要的PH缓冲液平衡8~10倍柱体积。

谢谢。我现在是用高10倍的浓度进行ph调整、上样效果还是可以的
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日事日毕，日清日高
5楼2016-06-17 19:30:07
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