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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 大引物PCR建立随机突变库
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xqiongwei

铁虫 (小有名气)

[求助] 大引物PCR建立随机突变库 已有3人参与

小妹最近在建立随机突变库，先是易错PCR，得到300bp左右的随机突变混合物，切胶纯化后将此混合物作为大引物，运用MEGAWHOP的方法进行全质粒PCR。然而问题来了，点样孔处很亮，其他地方看不到特异性的条带，然而，用未突变的片段作为引物是可以做出来的，已上图。我试过56度、68度、72度退火温度，都不行，快崩溃了，求大师指导一二。感激不尽。

大引物PCR建立随机突变库
图片1.png
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卓越来自专注
1楼 2016-06-03 21:36:13
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-06-06 19:45:27
xn8008: 应助指数+1 2016-06-28 07:04:27
拿没有突变的克隆好的质粒（转化甲基化菌株后提取）做模板，用易错PCR得到的胶回收产物做大引物PCR扩增，DpnI消化，然后转化。
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为什么
2楼2016-06-05 12:19:58
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xqiongwei

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 547star at 2016-06-05 12:19:58
拿没有突变的克隆好的质粒（转化甲基化菌株后提取）做模板，用易错PCR得到的胶回收产物做大引物PCR扩增，DpnI消化，然后转化。

谢谢您的回复哈，不过我就是这样做的呀，拿易错PCR得到的胶回收产物做大引物进行PCR，但是没有特异性条带，转化也没有菌落。作为对照，我拿未突变的片段作为大引物，却能得到全质粒。不知道易错的片段怎么就不行，现在好着急，不知道问题在哪儿
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卓越来自专注
3楼2016-06-06 10:58:52
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎发帖交流 2016-06-28 07:04:50
引用回帖:
3楼: Originally posted by xqiongwei at 2016-06-06 10:58:52
谢谢您的回复哈，不过我就是这样做的呀，拿易错PCR得到的胶回收产物做大引物进行PCR，但是没有特异性条带，转化也没有菌落。作为对照，我拿未突变的片段作为大引物，却能得到全质粒。不知道易错的片段怎么就不行， ...

估计跟二次PCR有关系，类似拿PCR产物加引物再扩增有时候又得不到目的带一样。不过，你都胶回收过了，除非胶回收的片段不对。考虑到上样孔有亮带，建议大引物PCR突变后，用单位点酶切一下，看看是不是变成多聚体了，如果是，胶回收连接后再转化看看。
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xqiongwei
为什么
4楼2016-06-06 18:14:52
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xqiongwei

铁虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by 547star at 2016-06-06 18:14:52
估计跟二次PCR有关系，类似拿PCR产物加引物再扩增有时候又得不到目的带一样。不过，你都胶回收过了，除非胶回收的片段不对。考虑到上样孔有亮带，建议大引物PCR突变后，用单位点酶切一下，看看是不是变成多聚体了， ...

多谢哈，我只能多个方法都试下啦
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卓越来自专注
5楼2016-06-07 13:13:57
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窗外风

银虫 (小有名气)
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2016-06-28 07:39:35
不知道楼主问题解决没有，我也是遇到同样的问题，若楼主解决了，希望指点一二。。。感谢
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风雨兼程！！
6楼2016-06-21 15:12:53
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xqiongwei

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 窗外风 at 2016-06-21 15:12:53
不知道楼主问题解决没有，我也是遇到同样的问题，若楼主解决了，希望指点一二。。。感谢

您好，我的大引物PCR还是没有P出来，至今还不知道问题在哪儿，希望知道的人指点一二啊，着急上火啊
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卓越来自专注
7楼2016-06-28 04:00:54
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gbc琛

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

楼主你问题解决了吗？我碰到了和你一样的问题啊，也是醉了，会不会是taq酶A尾的影响啊
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8楼2017-04-21 10:32:25
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看不见的世界

新虫 (初入文坛)
遇到同样问题，请问楼主解决了吗？

发自小木虫Android客户端
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9楼2018-09-11 16:43:45
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看不见的世界

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gbc琛 at 2017-04-21 10:32:25
楼主你问题解决了吗？我碰到了和你一样的问题啊，也是醉了，会不会是taq酶A尾的影响啊

遇到同样问题，请问您的问题解决了吗？

发自小木虫Android客户端
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10楼2018-09-11 16:44:33
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