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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 有谁做过反向PCR的，请教一个问题
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wangxuan

木虫 (著名写手)

[交流] 有谁做过反向PCR的，请教一个问题

请问染色酶切完以后的电泳条带是什么样的，
还有连接前要不要拿酚/氯仿抽提？我做了很久都没有扩增出来。
谢谢谢谢！！！！

[ Last edited by amisking on 2009-5-31 at 10:21 ]
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在其位，谋其政，成其事
1楼 2008-11-02 19:01:33
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wangxuan

木虫 (著名写手)
另外 请教一下大家都是如何扩增未知基因的
‘
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在其位，谋其政，成其事
2楼2008-11-02 19:33:52
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speculiar

银虫 (小有名气)
★
amisking(金币+1,VIP+0): 10-8 15:50
我认为反向PCR是最简单的扩增侧翼基因序列的方法了。
酶切后是需要酚氯仿抽提的，但是我一般用PCR纯化试剂盒纯化。
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3楼2008-11-02 23:00:23
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wangxuan

木虫 (著名写手)
谢谢  但是有一点：  
   我的酶切结果跑电泳没有形成条带 ，在紫外下出现一大片连续的荧光，请问这个结果你们有没有遇到过?
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在其位，谋其政，成其事
4楼2008-11-03 08:53:29
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speculiar

银虫 (小有名气)
这个是正常现象。
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5楼2008-11-03 20:53:01
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wangxuan

木虫 (著名写手)
那你扩增出来的片断亮吗？我做出来的很淡的
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在其位，谋其政，成其事
6楼2008-11-04 15:21:42
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njlf1258

引用回帖:
Originally posted by wangxuan at 2008-11-3 08:53:
谢谢  但是有一点：  
   我的酶切结果跑电泳没有形成条带 ，在紫外下出现一大片连续的荧光，请问这个结果你们有没有遇到过?

这个很有可能是你酶和底物之间的量不成比例所致。
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7楼2008-11-05 14:43:02
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annwt

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
amisking(金币+3,VIP+0): 10-8 15:50
从你的描述看，酶切彻底。
至于扩增基因，为什么用反向PCR，是扩启动子吗？
反向PCR的关键是模板DNA的连接问题，无法检测DNA是否连接，只能是看PCR的结果。而又不知道目的片段的长度，好像是行走在黑夜里，^_^。
祝你好运！
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8楼2008-11-05 17:14:06
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wangxuan

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by wangxuan at 11/4/08  15:21:
那你扩增出来的片断亮吗？我做出来的很淡的

那减少酶的用量是不是可以避免这一现象了呢？
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在其位，谋其政，成其事
9楼2008-11-05 17:53:26
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wangxuan

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by njlf1258 at 11/5/08  14:43:


这个很有可能是你酶和底物之间的量不成比例所致。

那减少酶的用量是不是可以避免这一现象了呢？
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在其位，谋其政，成其事
10楼2008-11-05 17:56:28
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