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叶小虫10

新虫 (小有名气)

[求助] 菌液检测 已有3人参与

我是括一个一千九百多bp的片段,我是用的高保真酶跑的,凝胶回收后检测条带可以,之后我用pEasy-Blunt zero 连接转化,之后挑取单菌落用原先的引物跑,但都是最底部的小片段,我将菌挑一部分到LB液体培养基中,摇了一段时间,菌液检测,什么都没有,我已经重复很多遍了,能想到的问题我都想到了,可是为什么啊,求助

菌液检测
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yeruge

新虫 (小有名气)

这个载体很好连的,菌落pcr预变性时间长点

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14楼2016-05-23 16:58:48
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18463102708

新虫 (初入文坛)

16楼2016-05-23 23:25:59
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18463102708

新虫 (初入文坛)

没连上也应该能跑出条带来呀,我感觉只要能长出单菌,就一定有质粒,没连上是一条比引物二具体大的片段,我感觉可能是后面菌体pcr的问题,后附我没连上的图

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17楼2016-05-23 23:26:09
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shanyoufeng

铜虫 (正式写手)

就是没连接成功,你的高保真酶和载体是否可以?比如说,酶具有连接A尾功能,而载体又是T载体。祝好!

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19楼2016-05-24 07:26:48
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yvonne9044

新虫 (正式写手)

你确定你的连接转化没问题么,有别人用你的药品或者方法成功过么

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2楼2016-05-21 21:30:01
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Liumengya

木虫 (正式写手)

菌液pcr用的什么酶?是扩增片段用米的酶吗?建议你用载体的通用引物,pcr预变性15分钟,试试看

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3楼2016-05-21 21:54:54
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Liumengya

木虫 (正式写手)

下面的条带是引物二聚体,引物加多了,20微体系加0.5引物就够

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4楼2016-05-21 21:56:36
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叶小虫10

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by Liumengya at 2016-05-21 21:56:36
下面的条带是引物二聚体,引物加多了,20微体系加0.5引物就够

我后面五个加了0.5的引物

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5楼2016-05-21 22:09:20
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叶小虫10

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by Liumengya at 2016-05-21 21:54:54
菌液pcr用的什么酶?是扩增片段用米的酶吗?建议你用载体的通用引物,pcr预变性15分钟,试试看

用的普通的混酶

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6楼2016-05-21 22:09:43
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叶小虫10

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by yvonne9044 at 2016-05-21 21:30:01
你确定你的连接转化没问题么,有别人用你的药品或者方法成功过么

我这种方法也是参考师兄师姐门的,小片段的成功过

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7楼2016-05-21 22:11:23
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叶小虫10

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by Liumengya at 2016-05-21 21:56:36
下面的条带是引物二聚体,引物加多了,20微体系加0.5引物就够

哎呀,我是10微的体系

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8楼2016-05-21 22:11:53
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叶小虫10

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by Liumengya at 2016-05-21 21:54:54
菌液pcr用的什么酶?是扩增片段用米的酶吗?建议你用载体的通用引物,pcr预变性15分钟,试试看

载体的通用引物是什么呢?actin?

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9楼2016-05-21 22:12:51
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Liumengya

木虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 叶小虫10 at 2016-05-21 22:12:51
载体的通用引物是什么呢?actin?
...

看你的载体应该是m13引物。如果用的是克隆试剂盒,里面应该会带引物的

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10楼2016-05-21 22:29:20
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