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急需帮助，快毕业了，WB还没做出来！！怎么办 已有13人参与
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摸爬滚打一个多月，从什么不懂做WB，还没做出来，然而快要毕业啦，愁死！！ 现在转膜8V20分钟，转后膜用丽春红染有蛋白质条带，胶考染大分子有一些条带，小分子（95kd以下）是干净的！ 一抗4℃过夜，后洗膜3*10min，二抗孵育1小时，洗膜3*10min 用的ECL发光剂，机器曝光五张图，每次一分钟（同实验室的也这样做，应该没问题，用同学爆出来的ECL试剂试过，也不是ECL的问题） 蛋白应该没问题，同学做WB时让同学帮忙跑了一道，用他们的beta-actin孵育可以看到结果！ 上个星期认为是抗体的原因（老师买的抗体是去年六月份的，快到期了，有可能降解了），希望老师重新买，哪里知道她重新买的国产的beta-actin，推介稀释比例1:3000啊！！昨天重新做了一次，还是没做出来！！ 现在想问有可能是什么原因呢！！挺急的，谢谢大家！！ |
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楼主首先要确定的自己的目标蛋白分子量有多大？ 假如目标分子量在100KD之内，分离胶浓度用10%即可，在80v-120V，电泳时间1.5小时左右，做到尽可能有效分离； 其次转膜时间过短，一般恒流200MA，转膜一个小时以上，可以翻开膜的边缘看看maker是不是都转上去了来做一个初步判断； 既然同学的actin可以出来，那说明你的蛋白样本还可以，接下来根据那个条带的颜色的深度，提升一下一抗浓度，孵育时放在摇床上，摇床速度慢一些。 曝光一分钟的才出现actin的话，你的上样量不够，一般上样总蛋白在20-50微克范围。 好运，我两个目标做了小半年，天天被老师训，不过还及时毕业了，庆幸~ 以前我可是要自己洗照片的，那个显影定影在小黑屋的感觉挺难忘的 |
10楼2016-05-23 16:28:08
2013101102
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2楼2016-05-21 18:09:49
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5楼2016-05-22 09:38:26
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没必要考染以及立春红染色，因为都不准，估计还是你提蛋白和出了问题，又或许蛋白浓度太低，我以前也是跟你一样，做多了就好，还有、蛋白上清液一定不能有基因组杂质，尽量清澈，然后一般抗体就算过了保质期一年半载也可以用、不过可能稀释度要提高，如果actin和marker跑的还行说明胶没问题再看看你的目的蛋白是否表达水平本身就比较低，如果低，那就重新提蛋白，高浓度并加大上样量 发自小木虫IOS客户端 |
6楼2016-05-22 15:59:37
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转膜时间有问题吧，8v？？？才几分钟！我做21k的蛋白300ma20分钟，50k的蛋白，300ma80分钟，参考一下，师姐做的一百多k的转100分钟左右 发自小木虫Android客户端 |
7楼2016-05-23 07:54:17
shenhaiwang
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8楼2016-05-23 09:32:55
junior850621
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增加转膜时间，至80v100min.二抗孵育时间增加至室温四小时，洗膜时间减至五分钟三次。给我一个过曝的结果先，再来分析。 发自小木虫Android客户端 |
9楼2016-05-23 13:19:10
