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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 标准曲线终点荧光信号值不一样怎么回事？
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yokina

新虫 (初入文坛)

[求助] 标准曲线终点荧光信号值不一样怎么回事？ 已有1人参与

做的四个10倍稀释的梯度，第三梯度信号值太低了，第四梯度完全没有信号了……跪求大神们帮帮忙！

标准曲线终点荧光信号值不一样怎么回事？


@biostar2009 发自小木虫Android客户端
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1楼 2016-05-16 16:50:46
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许彦

木虫 (正式写手)
说明你设计的反应灵敏度不好。

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yokina
2楼2016-05-17 05:36:40
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yokina

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 许彦 at 2016-05-17 05:36:40
说明你设计的反应灵敏度不好。

需要怎么再优化呢？

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3楼2016-05-17 06:38:13
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许彦

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yokina at 2016-05-17 06:38:13
需要怎么再优化呢？
...

这个我不会，我是做技术支持的，不是做研发的，我说的也只是一种可能，可以考虑换个高效的酶

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4楼2016-05-18 07:07:39
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a314919473

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
罗氏的仪器，可以直接问技术支持啊。
建议：1. 标准曲线，如果是相对定量的，可以使用2倍，5倍梯度稀释5个点，3重复，你这就单反应不严谨。
2. 看下试剂是不是过期了
3. 待检样本怎么样？说清楚地还能稍微帮你分析下，就直接一张图，找到原因才怪。
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yokina
有你真好
5楼2016-05-18 14:19:37
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cencheng

新虫 (小有名气)
我最近也遇到，

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6楼2016-05-18 22:23:20
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cencheng

新虫 (小有名气)
换一个染料试一试

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7楼2016-05-18 22:23:49
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yokina

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by a314919473 at 2016-05-18 14:19:37
罗氏的仪器，可以直接问技术支持啊。
建议：1. 标准曲线，如果是相对定量的，可以使用2倍，5倍梯度稀释5个点，3重复，你这就单反应不严谨。
2. 看下试剂是不是过期了
3. 待检样本怎么样？说清楚地还能稍微帮你分 ...

是taqman的绝对定量，打算做双探针的多重Pcr，模板用的两种puc质粒的混合，之前单重的时候还好好的。。。

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8楼2016-05-19 13:01:27
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a314919473

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

这个探针法多重PCR没有接触过，不过原理上完全可行。
无论是预实验还是正式实验都建议使用三重复，试剂很便宜的一个反应成本就是1-2元。
探针法都有这种通病就是平台期不会在一起，可以使用饱和染料做下，效果会好些。
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有你真好
9楼2016-05-19 15:06:56
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love_st

金虫 (著名写手)
探针不行，浓度梯度下不去，重新设计下吧，
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10楼2016-05-19 15:37:53
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