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AWANGJIACUO

新虫 (初入文坛)

[交流] 16s rDNA菌种鉴定TA克隆后测序引物及比对相关问题 已有2人参与

各位虫友，本人最近在做一份16s rDNA菌种鉴定，是肠道微生物提取的DNA，经27F和1492R扩增条带很亮，回收后直接测序峰图显示模板不纯，故做TA克隆，转化涂板后做菌落PCR显示大部分为阳性克隆，然后提取相应质粒进行测序，问题出现了：（1）用M13-47和M13-48测序结果峰图是OK的，但用27F和1492R测序的峰图仍显示模板不纯，我确定挑的是单菌落，问题出在哪了呢；（2）M13-47和M13-48测序结果拼接后比对的结果,有个不明白的地方是，比对的参考菌株显示时是complete genome的partial sequence，而不是16S ribosomal RNA,请问各位大神这是正常现象吗？
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好好活吧，因为我们会死很久。。。
1楼 2016-05-09 17:03:27
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cyhm082

捐助贵宾 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
那你尝试用27F和1492R以质粒为模板进行扩增，再以PCR产物测序看看咯

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4楼2016-05-11 22:38:57
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yesucao

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1、楼主提供的肠道微生物，自然DNA模板就混合的，16S扩增的条带都是1500bp，相当于测序的模板是非单一的，测序会出现杂峰的情况；
2、楼主后期做TA克隆是正确的方案，将后期的拼接结果在NCBI中进行比对就可以了。
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2楼2016-05-09 19:56:28
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AWANGJIACUO

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yesucao at 2016-05-09 19:56:28
1、楼主提供的肠道微生物，自然DNA模板就混合的，16S扩增的条带都是1500bp，相当于测序的模板是非单一的，测序会出现杂峰的情况；
2、楼主后期做TA克隆是正确的方案，将后期的拼接结果在NCBI中进行比对就可以了。

谢谢回复  但是还是没能回答我的问题
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好好活吧，因为我们会死很久。。。
3楼2016-05-09 22:31:46
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AWANGJIACUO

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cyhm082 at 2016-05-11 22:38:57
那你尝试用27F和1492R以质粒为模板进行扩增，再以PCR产物测序看看咯

嗯嗯 谢谢 我试试
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好好活吧，因为我们会死很久。。。
5楼2016-05-12 15:37:04
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