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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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8095172666

银虫 (小有名气)

[求助] 相似性很高的基因如何敲除 已有2人参与

最近在做酵母细胞基因的敲除,三个基因FLO1、FLO5、FLO9,三个基因的相似性非常高。实验室一直用的都是同源重组的方法,找的flo1的同源臂几乎在另外两个基因中都可以配对上。现已将一个flo1上下游同源臂的带卡纳抗性的敲片成功导入细胞,且可在抗性平板上生长。但是由于这三个基因的相似度极高,会不会有这样的可能,敲片最后是在细胞内的另外两个基因上同源重组了。有没有什么方法可以检验的?
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原海亮

木虫 (著名写手)

感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2016-06-04 22:00:42
同源臂不可以调整么?

发自小木虫Android客户端
天空才是极限,我有信心飞的更高!
2楼2016-05-04 17:07:33
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8095172666

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-05-04 17:07:33
同源臂不可以调整么?

整个基因的相似度都非常高,找不到差异性比较大的同源臂啊
3楼2016-05-04 19:50:50
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junior850621

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-06-04 22:01:04
确实很难。我试过lentiCrispr,感觉不如同源重组踏实。不知楼主什么原因也不用?我现在同源重组,只把最前端ATG附近的部分稍微去掉一点,应该可以达到目的了。不知楼主ATG离基因5‘以外的部分有多远,其实重组掉一小部分即可。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

4楼2016-05-09 22:05:48
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8095172666

银虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by junior850621 at 2016-05-09 22:05:48
确实很难。我试过lentiCrispr,感觉不如同源重组踏实。不知楼主什么原因也不用?我现在同源重组,只把最前端ATG附近的部分稍微去掉一点,应该可以达到目的了。不知楼主ATG离基因5‘以外的部分有多远,其实重组掉一小 ...

我根据你的说法看了一下,但是最多只能保证上同源臂不同,下同源臂的相似性还是很高。如果是这样的话,还能准确的敲除吗?谢谢
5楼2016-05-10 09:52:04
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junior850621

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 8095172666 at 2016-05-10 09:52:04
我根据你的说法看了一下,但是最多只能保证上同源臂不同,下同源臂的相似性还是很高。如果是这样的话,还能准确的敲除吗?谢谢...

建议做着试一下吧,这个不好说。曲高和寡,现在大家都喜欢吃快餐,lentiCrispr才这么流行,很多人也在骗自己这个没有off target。既然选择了做重组,就意味着更多工作量,但结果肯定令人信服。如果需要的话可以边做边跟我讨论。

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6楼2016-05-10 13:53:13
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8095172666

银虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by junior850621 at 2016-05-10 13:53:13
建议做着试一下吧,这个不好说。曲高和寡,现在大家都喜欢吃快餐,lentiCrispr才这么流行,很多人也在骗自己这个没有off target。既然选择了做重组,就意味着更多工作量,但结果肯定令人信服。如果需要的话可以边做 ...

恩,好的,非常感谢
7楼2016-05-10 20:25:39
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8095172666

银虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by junior850621 at 2016-05-10 13:53:13
建议做着试一下吧,这个不好说。曲高和寡,现在大家都喜欢吃快餐,lentiCrispr才这么流行,很多人也在骗自己这个没有off target。既然选择了做重组,就意味着更多工作量,但结果肯定令人信服。如果需要的话可以边做 ...

你好,最近我试着用你说的方法将flo1基因的最上游200bp替换成抗性片段,菌落PCR和最后片段测序都是正确的,但是在做表型实验的时候是与文献中报道的截然相反的。有没有这种可能跟在抗性基因后的剩下的flo1基因的片段继续表达,蛋白依然有活性。由于敲除菌落在抗性平板上生长使得抗性基因带着flo1过表达,导致了与文献相反的实验结果。谢谢
8楼2016-06-04 20:51:40
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junior850621

铁杆木虫 (著名写手)

不知敲掉的外显子部分是多少bp,一般去掉不是三的整数倍的话可以造成移码。但你的情况比较特殊,第一个外显子去掉,后面确实可能还会表达截断体蛋白,难道你手头没有抗体吗?跑个蛋白胶,竖直方向裁膜,看有没有分子量小的蛋白表达。

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9楼2016-06-05 01:27:52
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8095172666

银虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by junior850621 at 2016-06-05 01:27:52
不知敲掉的外显子部分是多少bp,一般去掉不是三的整数倍的话可以造成移码。但你的情况比较特殊,第一个外显子去掉,后面确实可能还会表达截断体蛋白,难道你手头没有抗体吗?跑个蛋白胶,竖直方向裁膜,看有没有分子 ...

请问你说的是什么抗体呢,是我目的基因蛋白的抗体吗?
10楼2016-06-05 08:42:02
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