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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 双重PCR外面的长的目的条带扩不出来
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Carson同学

新虫 (初入文坛)

[求助] 双重PCR外面的长的目的条带扩不出来 已有1人参与

只用外面的一对引物扩增时条带特异单一很亮，但是加进另两条引物做（分别跟外面那对引物的上游和下游结合）双重PCR扩增时就只有里面较小的两条目的条带，外面的长的目的条带就不见了，这是怎么回事，应该怎么办？
我用的25微升体系，外面的引物上下游各加了2微升，里面的引物上游和下游各加1微升(分别跟外引物上下游结合)用的天根的mix

@biostar2009 @youlinglyw @飞约疯人院 @wizardfan 发自小木虫IOS客户端
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1楼 2016-04-25 20:14:53
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菜头Q

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不知道你说的双重PCR是不是巢式啊……还有引物位置能不能画个图简略表示一下。如果单纯从PCR条件这块分析的话，建议你把退火温度根据每个引物的Tm值设置成梯度试试；从PCR体系这块来看我觉得你的引物加的有问题，就相当于中间设置了不可跨越的拦截，没办法收到信号一个道理。
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2楼2016-04-25 20:30:10
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Carson同学

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 菜头Q at 2016-04-25 20:30:10
不知道你说的双重PCR是不是巢式啊……还有引物位置能不能画个图简略表示一下。如果单纯从PCR条件这块分析的话，建议你把退火温度根据每个引物的Tm值设置成梯度试试；从PCR体系这块来看我觉得你的引物加的有问题，就 ...

对，套式的
双重PCR外面的长的目的条带扩不出来



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3楼2016-04-25 22:38:22
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菜头Q

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Carson同学 at 2016-04-25 22:38:22
对，套式的

...

套式PCR的话肯定是有两步组成的，第一步就是你图中F1和R1为引物，特异性扩增较长的片段；第二步建议你分别加入F1/R2和R1/F2做成两个体系，分别得到以第一步产物为模板的第二步的产物，而不能同时把三对引物都放进去。
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4楼2016-04-26 14:02:30
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yfd900825

银虫 (正式写手)
不懂你的目的是什么?_?要得到比较长的F1 R1的片段产物吗？

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5楼2016-04-27 22:29:50
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Carson同学

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yfd900825 at 2016-04-27 22:29:50
不懂你的目的是什么?_?要得到比较长的F1 R1的片段产物吗？

对，F1与R1的条带扩不出来，但是单独扩的时候能出来

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6楼2016-04-28 07:30:19
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