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1379452403

新虫 (初入文坛)

[交流] PCR体系

PCR体系一般根据什么确定啊，10，20，50ul体系有什么不同啊，其中的各个温度和时间怎么确定啊，都依据什么啊，跪求大神指导啊，小菜鸟跪求啊

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1楼 2016-04-22 15:57:12
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red-bri

新虫 (小有名气)
看你的目的，一般检测下，20ul足够，要是回收条带的话，50ul。

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3楼2016-04-22 17:08:38
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半仙0356

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
看你自己要做多少东西咯，

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2楼2016-04-22 16:34:14
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1379452403

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 半仙0356 at 2016-04-22 16:34:14
看你自己要做多少东西咯，

时间怎么设呢，跟酶有关吗

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4楼2016-04-22 18:39:20
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1379452403

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by red-bri at 2016-04-22 17:08:38
看你的目的，一般检测下，20ul足够，要是回收条带的话，50ul。

时间怎么设呢，跟酶有关吗

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5楼2016-04-22 18:39:36
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
★
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对于一般的PCR程序，有两个参数很重要，一个是退火温度，这个与PCR引物有关，一般设置在引物Tm与（Tm-5）范围内；另一个是延伸时间，这个与产物大小有关，对于普通Taq酶，按每分钟1kb计算，可以稍长但不能短，对于特殊的快酶则视具体情况而定。
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6楼2016-04-22 18:46:29
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半仙0356

新虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
4楼: Originally posted by 1379452403 at 2016-04-22 18:39:20
时间怎么设呢，跟酶有关吗
...

我做的是25μL体系，用的r Taq酶，目标产物是150bp，94度预变性5分钟，94度变性30S，退火30S，72度延伸30S，72度7分钟，循环为30～仅供参考

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7楼2016-04-22 20:59:00
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王箬竹

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
pcr体系一般都是15微升，过多浪费样品和试剂，过少容易蒸干（一般如果只是做检测，我都会加液体石蜡，防蒸发），如果是要做切胶回收，测序，一般都是选择50体系。

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8楼2016-04-22 22:21:17
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王箬竹

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
常规PCR: 变性温度一般94，退火温度根据你的引物的Tm值而定，延伸温度一般72度（特殊PCR各个温度根据需求定）

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9楼2016-04-22 22:24:17
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王箬竹

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
变性时间一般30秒就够，退火时间20~30秒，延伸时间根据聚合酶的反应和扩增前段大小而定，酶的反应速度说明书上都有！祝好运

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10楼2016-04-22 22:27:56
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