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1379452403

新虫 (初入文坛)

[交流] PCR体系

PCR体系一般根据什么确定啊,10,20,50ul体系有什么不同啊,其中的各个温度和时间怎么确定啊,都依据什么啊,跪求大神指导啊,小菜鸟跪求啊

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red-bri

新虫 (小有名气)

看你的目的,一般检测下,20ul足够,要是回收条带的话,50ul。

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3楼2016-04-22 17:08:38
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半仙0356

新虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
看你自己要做多少东西咯,

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2楼2016-04-22 16:34:14
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1379452403

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 半仙0356 at 2016-04-22 16:34:14
看你自己要做多少东西咯,

时间怎么设呢,跟酶有关吗

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4楼2016-04-22 18:39:20
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1379452403

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by red-bri at 2016-04-22 17:08:38
看你的目的,一般检测下,20ul足够,要是回收条带的话,50ul。

时间怎么设呢,跟酶有关吗

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5楼2016-04-22 18:39:36
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)


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对于一般的PCR程序,有两个参数很重要,一个是退火温度,这个与PCR引物有关,一般设置在引物Tm与(Tm-5)范围内;另一个是延伸时间,这个与产物大小有关,对于普通Taq酶,按每分钟1kb计算,可以稍长但不能短,对于特殊的快酶则视具体情况而定。
6楼2016-04-22 18:46:29
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半仙0356

新虫 (正式写手)


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引用回帖:
4楼: Originally posted by 1379452403 at 2016-04-22 18:39:20
时间怎么设呢,跟酶有关吗
...

我做的是25μL体系,用的r Taq酶,目标产物是150bp,94度预变性5分钟,94度变性30S,退火30S,72度延伸30S,72度7分钟,循环为30~仅供参考

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7楼2016-04-22 20:59:00
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王箬竹

新虫 (小有名气)


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pcr体系一般都是15微升,过多浪费样品和试剂,过少容易蒸干(一般如果只是做检测,我都会加液体石蜡,防蒸发),如果是要做切胶回收,测序,一般都是选择50体系。

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8楼2016-04-22 22:21:17
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王箬竹

新虫 (小有名气)


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常规PCR: 变性温度一般94,退火温度根据你的引物的Tm值而定,延伸温度一般72度(特殊PCR各个温度根据需求定)

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9楼2016-04-22 22:24:17
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王箬竹

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
变性时间一般30秒就够,退火时间20~30秒,延伸时间根据聚合酶的反应和扩增前段大小而定,酶的反应速度说明书上都有!祝好运

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10楼2016-04-22 22:27:56
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