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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 为什么要进行亚克隆？
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成石

银虫 (正式写手)

[求助] 为什么要进行亚克隆？ 已有2人参与

分子小白，问下：在做原核构建或者真核构建的时候，为什么要先进行亚克隆pMD-18T？而不直接将目的基因与表达载体进行酶切酶连，构建重组子？
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置心一处，置身一处，无事不办！
1楼 2016-04-16 10:17:26
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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成石: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 感谢网友，你的回答很详细，很有道理。 2016-04-17 17:30:24
这个没有要求必须先克隆到T载体，再做亚克隆的，和一般实验室的操作习惯有关而已，特别对于刚进入实验室的同学，往往是希望要求实验更加规范些，或者说更加严谨一些。当然连接t载体自然是有它的优点的，首先，对于你pcr产物没有酶切位点的，通过连接T载体，在进行酶切，来获得携带有合适酶切位点的pcr产物。其次，对于你pcr引物已经携带酶切位点的，连接T载体后进行酶切，比你直接对pcr产物进行酶切的效率要高的多，而且从载体上切片段，可以通过胶回收目的片段，非常直观的判断片段的酶切处理是否完全，而pcr产物酶切前后在电泳时没有明显差别，往往会有酶切不完全情况，影响后续的连接效率（实验操作熟练以后，完全可以直接克隆）。最后，对于有些载体在大肠中无法复制，或者说质粒提取比较麻烦，那么目的片段的测序任务就可以借助T载体来完成，祝好！

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
10楼2016-04-16 21:22:09
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bobofof

铜虫 (小有名气)
我都是直接连的。。

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2楼2016-04-16 12:29:18
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天机哥哥

禁虫 (小有名气)
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3楼2016-04-16 19:54:45
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yvonne9044

新虫 (正式写手)
方便测序，保存

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4楼2016-04-16 20:15:39
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成石

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 天机哥哥 at 2016-04-16 19:54:45
方便呗，TA克隆的优点在于它能够直接与PCR反应的目的基因直接连接，之后只需要在TA克隆载体上找一个含目的基因的酶切位点酶切下来，然后与表达载体上对应相同的酶切位点酶连即可！！这其中就省去了在目的基因上去寻 ...

如果目的基因已经设计了引物，包括酶切位点。此酶切位点与表达载体上带的酶切位点相同。那该如何？是不是可以直接拿目的基因和表达载体分别双酶切，然后再酶连，构建重组表达载体？
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5楼2016-04-16 20:19:01
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成石

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yvonne9044 at 2016-04-16 20:15:39
方便测序，保存

目的不就是为了将目的基因与表达载体重组在一起吗？那直接一点，将重组好的载体，拿去测序不是也一样？更加直接了当。。。
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6楼2016-04-16 20:21:14
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成石

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yvonne9044 at 2016-04-16 20:15:39
方便测序，保存

目的不就是为了将目的基因与表达载体重组在一起吗？那直接一点，将重组好的载体，拿去测序不是也一样？更加直接了当。。。
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7楼2016-04-16 20:24:29
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成石

银虫 (正式写手)
1.通过PCR的方法扩增目的基因片断的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列。2.以便后期双酶切后方便获得粘性末端，提高目的片度与表达载体的连接效率。3.也可以不用亚克隆，可以在设计引物的时候在引物的5'端加上酶切位点,比如你选中XXXYYY位点你可以把引物设计为AA－XXXYYY－AGCT(AGCT 代表你原来的引物序列），我一般在头上加2个A,这样酶切效果好一些。4.百度百科：对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。
（以上是我搜索的答案，请大家讨论讨论。）
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8楼2016-04-16 20:29:53
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天机哥哥

禁虫 (小有名气)
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9楼2016-04-16 20:51:31
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