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成石银虫 (正式写手)
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为什么要进行亚克隆？ 已有2人参与
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| 分子小白，问下：在做原核构建或者真核构建的时候，为什么要先进行亚克隆pMD-18T？而不直接将目的基因与表达载体进行酶切酶连，构建重组子？ |
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【答案】应助回帖
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成石: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 感谢网友，你的回答很详细，很有道理。 2016-04-17 17:30:24
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这个没有要求必须先克隆到T载体，再做亚克隆的，和一般实验室的操作习惯有关而已，特别对于刚进入实验室的同学，往往是希望要求实验更加规范些，或者说更加严谨一些。当然连接t载体自然是有它的优点的，首先，对于你pcr产物没有酶切位点的，通过连接T载体，在进行酶切，来获得携带有合适酶切位点的pcr产物。其次，对于你pcr引物已经携带酶切位点的，连接T载体后进行酶切，比你直接对pcr产物进行酶切的效率要高的多，而且从载体上切片段，可以通过胶回收目的片段，非常直观的判断片段的酶切处理是否完全，而pcr产物酶切前后在电泳时没有明显差别，往往会有酶切不完全情况，影响后续的连接效率（实验操作熟练以后，完全可以直接克隆）。最后，对于有些载体在大肠中无法复制，或者说质粒提取比较麻烦，那么目的片段的测序任务就可以借助T载体来完成，祝好！ 发自小木虫Android客户端 |
10楼2016-04-16 21:22:09
bobofof
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2楼2016-04-16 12:29:18
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3楼2016-04-16 19:54:45
yvonne9044
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7楼2016-04-16 20:24:29
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1.通过PCR的方法扩增目的基因片断的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列。2.以便后期双酶切后方便获得粘性末端，提高目的片度与表达载体的连接效率。3.也可以不用亚克隆，可以在设计引物的时候在引物的5'端加上酶切位点,比如你选中XXXYYY位点你可以把引物设计为AA－XXXYYY－AGCT(AGCT 代表你原来的引物序列），我一般在头上加2个A,这样酶切效果好一些。4.百度百科：对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。 （以上是我搜索的答案，请大家讨论讨论。） |
8楼2016-04-16 20:29:53
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9楼2016-04-16 20:51:31
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