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kaoyanjiu

新虫 (小有名气)

[交流] 求助,引物设计的相关问题若干,关于酶切位点的保护碱基的。 已有5人参与

做PCR,根据我的目的序列设计引物,我的上游引物加入XhoⅠ酶切位点,5‘端的保护碱基应该怎么设计呢?下游的是Not I酶切位点,这个位点应该加什么样的保护碱基呢?
我在网上查找也只找到如图这样的列表,我需要加多少个,有什么种类要求吗?
顺便说一下我的模版是反转的cDNA。

求助,引物设计的相关问题若干,关于酶切位点的保护碱基的。
保护碱基表.jpg
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)


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加保护碱基的目的是方便后面酶切。
如果PCR后不是直接用于酶切连接的,比如先连T载体的,可以不加保护碱基;直接用PCR产物酶切连接的,要在引物的5‘端加保护碱基,为了保证酶切效率,建议按照保护碱基表上酶切效率高的加。
2楼2016-04-15 09:23:02
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王箬竹

新虫 (小有名气)


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3楼2016-04-16 00:31:51
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王箬竹

新虫 (小有名气)

找切割效率高的保护碱基

发自小木虫Android客户端
4楼2016-04-16 00:32:33
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jingyu90217

新虫 (小有名气)


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引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2016-04-15 09:23:02
加保护碱基的目的是方便后面酶切。
如果PCR后不是直接用于酶切连接的,比如先连T载体的,可以不加保护碱基;直接用PCR产物酶切连接的,要在引物的5‘端加保护碱基,为了保证酶切效率,建议按照保护碱基表上酶切效率 ...

如果最后要上表达载体。上T载前也要有保护碱基啊

发自小木虫IOS客户端
5楼2016-04-16 00:34:49
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)


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引用回帖:
5楼: Originally posted by jingyu90217 at 2016-04-16 00:34:49
如果最后要上表达载体。上T载前也要有保护碱基啊
...

T载体上本身的序列就是保护碱基,足够长。
6楼2016-04-16 11:10:56
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tangbowen

新虫 (小有名气)


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保护碱基是为了保证酶切效率,与连不连载体无关,限制性内切酶切线性效率很低,还有,不连接载体测序后,你敢切吗?

发自小木虫IOS客户端
7楼2016-04-17 10:28:05
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醉_梦

新虫 (初入文坛)


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最好还是采用中间载体最好,引物就不用加保护碱基。PCR产物酶切实在效率低且不易判断是否成功
8楼2016-04-17 16:17:40
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