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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助，引物设计的相关问题若干，关于酶切位点的保护碱基的。
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kaoyanjiu

新虫 (小有名气)

[交流] 求助，引物设计的相关问题若干，关于酶切位点的保护碱基的。 已有5人参与

做PCR，根据我的目的序列设计引物，我的上游引物加入XhoⅠ酶切位点，5‘端的保护碱基应该怎么设计呢？下游的是Not I酶切位点，这个位点应该加什么样的保护碱基呢？
我在网上查找也只找到如图这样的列表，我需要加多少个，有什么种类要求吗？
顺便说一下我的模版是反转的cDNA。

求助，引物设计的相关问题若干，关于酶切位点的保护碱基的。
保护碱基表.jpg
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1楼 2016-04-14 12:37:44
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★
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加保护碱基的目的是方便后面酶切。
如果PCR后不是直接用于酶切连接的，比如先连T载体的，可以不加保护碱基；直接用PCR产物酶切连接的，要在引物的5‘端加保护碱基，为了保证酶切效率，建议按照保护碱基表上酶切效率高的加。
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2楼2016-04-15 09:23:02
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王箬竹

新虫 (小有名气)
★
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求助，引物设计的相关问题若干，关于酶切位点的保护碱基的。-1

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3楼2016-04-16 00:31:51
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王箬竹

新虫 (小有名气)
找切割效率高的保护碱基

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4楼2016-04-16 00:32:33
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jingyu90217

新虫 (小有名气)
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引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2016-04-15 09:23:02
加保护碱基的目的是方便后面酶切。
如果PCR后不是直接用于酶切连接的，比如先连T载体的，可以不加保护碱基；直接用PCR产物酶切连接的，要在引物的5‘端加保护碱基，为了保证酶切效率，建议按照保护碱基表上酶切效率 ...

如果最后要上表达载体。上T载前也要有保护碱基啊

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5楼2016-04-16 00:34:49
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by jingyu90217 at 2016-04-16 00:34:49
如果最后要上表达载体。上T载前也要有保护碱基啊
...

T载体上本身的序列就是保护碱基，足够长。
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6楼2016-04-16 11:10:56
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tangbowen

新虫 (小有名气)
★
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保护碱基是为了保证酶切效率，与连不连载体无关，限制性内切酶切线性效率很低，还有，不连接载体测序后，你敢切吗？

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7楼2016-04-17 10:28:05
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醉_梦

新虫 (初入文坛)
★
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最好还是采用中间载体最好，引物就不用加保护碱基。PCR产物酶切实在效率低且不易判断是否成功
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8楼2016-04-17 16:17:40
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