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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求救，NEB的Q5高保真酶扩增出现问题
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 求救，NEB的Q5高保真酶扩增出现问题 已有2人参与

各位大神，如题：我用普通的Taq酶扩增目的片段1.6Kb左右，可以扩出，且比较亮，但是下方有些非特异带。换用NEB的Q5高保真酶，同样的条件，就啥也没有了，体系和程序用的说明书推荐的；以前看过虫友遇到过这种问题，没想到今天自己也遇到了，想问问大家的都最后如何解决的啊？交流一下吧。郁闷啊
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1楼 2016-04-07 21:25:44
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梅太奇阿拉干

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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lwk5716: 金币+5 2016-04-08 10:05:22
适当降低退火温度试试吧

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2楼2016-04-07 23:36:23
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梅太奇阿拉干

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by lwk5716 at 2016-04-08 21:08:36
我还想问您个问题，那就是有人说可以把普通Taq酶和高保真的酶混合起来扩增，可以提高效率，也能有保真性，您知道比例吗？可以这么干吗？扩出来的是加A尾巴的吗？...

这两个酶的buffer不一样啊，一起用应该有影响吧，这么做我也第一次听说，也不懂呀

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5楼2016-04-08 22:57:54
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wqqlb

铁虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
lwk5716: 金币+2 2016-04-10 09:39:36
尝试下降低模板的浓度

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明确目标牵引能量 行之所想 会有所得
6楼2016-04-09 00:30:58
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dkyy970111

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
lwk5716: 金币+3 2016-04-10 09:39:49
引用回帖:
4楼: Originally posted by lwk5716 at 2016-04-08 21:08:36
我还想问您个问题，那就是有人说可以把普通Taq酶和高保真的酶混合起来扩增，可以提高效率，也能有保真性，您知道比例吗？可以这么干吗？扩出来的是加A尾巴的吗？...

不能这么用，Q5具有外切酶活性，会切除3'突出末端，使片段平端话。

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打铁还要自身硬
8楼2016-04-10 09:07:01
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Liumengya

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
高保真酶严格按照说明书来，别安普通酶的条件

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11楼2016-04-12 23:02:37
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普通回帖

lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 梅太奇阿拉干 at 2016-04-07 23:36:23
适当降低退火温度试试吧

今天准备做个温度梯度试试，谢啦。
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3楼2016-04-08 10:06:14
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 梅太奇阿拉干 at 2016-04-07 23:36:23
适当降低退火温度试试吧

我还想问您个问题，那就是有人说可以把普通Taq酶和高保真的酶混合起来扩增，可以提高效率，也能有保真性，您知道比例吗？可以这么干吗？扩出来的是加A尾巴的吗？
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4楼2016-04-08 21:08:36
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 梅太奇阿拉干 at 2016-04-08 22:57:54
这两个酶的buffer不一样啊，一起用应该有影响吧，这么做我也第一次听说，也不懂呀
...

嗯，谢谢你的回答。

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7楼2016-04-09 08:13:06
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i760912798

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我用普通taq酶和高保真酶扩增过同一基因，退火温度完全不一样，你可以用高保真酶说明书上较低的退火温度扩增一下试一下！

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9楼2016-04-10 12:11:57
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by i760912798 at 2016-04-10 12:11:57
我用普通taq酶和高保真酶扩增过同一基因，退火温度完全不一样，你可以用高保真酶说明书上较低的退火温度扩增一下试一下！

好的，谢谢你的建议。
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10楼2016-04-10 15:59:25
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