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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 求助 质粒诱导原核表达总是不成功！
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妞小胖儿

新虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by 沉默、颜泪 at 2016-03-31 23:33:15
如果前期的工作都正确。考虑一下载体的插入位置，是否能正常转录（有这种情况，标记基因表达了，而目的基因沉默）

谢谢！我用的是最常规的插入位置 xhol EcoR1 怎么看插入片段有没有问题啊？

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11楼2016-04-02 00:51:04
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elric

新虫 (著名写手)
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10楼: Originally posted by 妞小胖儿 at 2016-04-02 00:47:44
谢谢你！意思是我在操作中有问题么？我又重新挑了另一种蛋白作原核表达，还是菌液包含体都没有
...

看一下会不会IPTG失效了，我之前就遇到这个情况，因为IPTG用量很少，放的时间长了就会失效，借的别人的试试
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12楼2016-04-02 01:50:59
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沉默、颜泪

木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 妞小胖儿 at 2016-04-02 00:51:04
谢谢！我用的是最常规的插入位置 xhol EcoR1 怎么看插入片段有没有问题啊？
...

重组质粒有几个必不可少的序列，还要注意质粒转录的方向。       比如:你目的基因插在启动子之前，那一般不会成功转录，但是标记基因可以表达。

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13楼2016-04-02 09:10:48
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妞小胖儿

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by elric at 2016-04-02 01:50:59
看一下会不会IPTG失效了，我之前就遇到这个情况，因为IPTG用量很少，放的时间长了就会失效，借的别人的试试...

您好 我后来换了别人表达成功用的IPTG 然后我发现在OD值 0.6-0.8的时候加入1微升0.1的IPTG 18°过夜。最后只有少量几管菌摇起来了。其他的变得反而十分清亮。您说这是什么问题啊？谢谢！！

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14楼2016-04-10 20:27:09
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elric

新虫 (著名写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 沉默、颜泪 at 2016-04-02 09:10:48
重组质粒有几个必不可少的序列，还要注意质粒转录的方向。       比如:你目的基因插在启动子之前，那一般不会成功转录，但是标记基因可以表达。
...

一般商用载体不会出现问题的，只要你插入的序列没问题，其他的载体序列都是固定的，RE site也是固定的，转录方向也是确定的，不会出现你说的问题，我相信。
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15楼2016-04-11 02:08:15
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elric

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by 妞小胖儿 at 2016-04-10 20:27:09
您好 我后来换了别人表达成功用的IPTG 然后我发现在OD值 0.6-0.8的时候加入1微升0.1的IPTG 18°过夜。最后只有少量几管菌摇起来了。其他的变得反而十分清亮。您说这是什么问题啊？谢谢！！
...

会不会是温度过低了，20度或24度试试呢，变得清亮，可能是没有长吧
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16楼2016-04-11 02:09:04
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