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yaya0922

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因敲除,sacB负筛选的问题 已有2人参与

改造的pK18mobsacB质粒具有氯霉素和卡那抗性,受体菌具有利福平抗性,进行同源重组,得到单交换菌株(具有氯霉素、卡那和利福平抗性),但是单交换菌株在平板上划线,不知道为什么四区只长一区?(划了两次都是这样,没有单菌落)。在LB中(含利福平)摇菌大约20h,涂到5%蔗糖培养基上,原液一片片的,像层膜,但10-1,,10-2,10-3未长,应该怎么办?
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jueie

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
大肠杆菌可以用RED同源重组来作敲除,比这个pK18高效

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now!
7楼2016-03-28 18:19:36
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fenghan06

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
sacB反筛有些菌是做不出来的, 譬如大肠杆菌, 就有些菌种做得出, 有些菌做不出

换下培养基, LB里不加氯化钠试看看, 这个基本上在大肠杆菌里最好不加。 具体原因我也不是很清楚, 只是知道会影响实验, 本人猜是和某些使用钠离子为动力的antiporter efflux pump在有钠离子时候能排出蔗糖有关。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

2楼2016-03-27 14:02:32
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fenghan06

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

真的还有问题建议使用rpsL150对streptomycin的抗性来做反筛

我做的结果是每五个单菌落就有一个是阳性结果, 教了几个现在实验室的博士生做也都分别在不同菌株里成功。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

3楼2016-03-27 14:05:03
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fenghan06

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by fenghan06 at 2016-03-27 14:05:03
真的还有问题建议使用rpsL150对streptomycin的抗性来做反筛

我做的结果是每五个单菌落就有一个是阳性结果, 教了几个现在实验室的博士生做也都分别在不同菌株里成功。

但是这个是在大肠杆菌里做的
4楼2016-03-27 14:05:59
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