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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 培养/筛选 » 基因敲除，sacB负筛选的问题
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yaya0922

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因敲除，sacB负筛选的问题 已有2人参与

改造的pK18mobsacB质粒具有氯霉素和卡那抗性，受体菌具有利福平抗性，进行同源重组，得到单交换菌株（具有氯霉素、卡那和利福平抗性），但是单交换菌株在平板上划线，不知道为什么四区只长一区？（划了两次都是这样，没有单菌落）。在LB中（含利福平）摇菌大约20h，涂到5%蔗糖培养基上，原液一片片的，像层膜，但10-1，,10-2，10-3未长，应该怎么办？
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1楼 2016-03-27 08:58:30
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yaya0922

新虫 (初入文坛)
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引用回帖:
2楼: Originally posted by fenghan06 at 2016-03-27 14:02:32
sacB反筛有些菌是做不出来的， 譬如大肠杆菌， 就有些菌种做得出， 有些菌做不出

换下培养基， LB里不加氯化钠试看看， 这个基本上在大肠杆菌里最好不加。 具体原因我也不是很清楚， 只是知道会影响实验， 本人猜 ...

我做的这个菌要加氯化钠。以前做的这个菌其他基因敲除做出来过，当时得到许多回复突变的，说明sacB还是起作用了。

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5楼2016-03-27 17:39:30
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trhgy

铁虫 (初入文坛)
我也用pk18mobsacb做啊，蔗糖筛选全是假阳性啊

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10楼2018-08-22 17:34:18
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fenghan06

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

真的还有问题建议使用rpsL150对streptomycin的抗性来做反筛

我做的结果是每五个单菌落就有一个是阳性结果， 教了几个现在实验室的博士生做也都分别在不同菌株里成功。
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yaya0922
3楼2016-03-27 14:05:03
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fenghan06

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
sacB反筛有些菌是做不出来的， 譬如大肠杆菌， 就有些菌种做得出， 有些菌做不出

换下培养基， LB里不加氯化钠试看看， 这个基本上在大肠杆菌里最好不加。 具体原因我也不是很清楚， 只是知道会影响实验， 本人猜是和某些使用钠离子为动力的antiporter efflux pump在有钠离子时候能排出蔗糖有关。
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yaya0922
2楼2016-03-27 14:02:32
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fenghan06

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by fenghan06 at 2016-03-27 14:05:03
真的还有问题建议使用rpsL150对streptomycin的抗性来做反筛

我做的结果是每五个单菌落就有一个是阳性结果， 教了几个现在实验室的博士生做也都分别在不同菌株里成功。

但是这个是在大肠杆菌里做的
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4楼2016-03-27 14:05:59
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yaya0922

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by fenghan06 at 2016-03-27 14:05:03
真的还有问题建议使用rpsL150对streptomycin的抗性来做反筛

我做的结果是每五个单菌落就有一个是阳性结果， 教了几个现在实验室的博士生做也都分别在不同菌株里成功。

谢谢你的建议！

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6楼2016-03-27 17:41:39
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jueie

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
大肠杆菌可以用RED同源重组来作敲除，比这个pK18高效
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yaya0922
now！
7楼2016-03-28 18:19:36
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yaya0922

新虫 (初入文坛)
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引用回帖:
7楼: Originally posted by jueie at 2016-03-28 18:19:36
大肠杆菌可以用RED同源重组来作敲除，比这个pK18高效

哦，谢谢。我的不是大肠杆菌

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8楼2016-03-28 18:44:09
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llm151789

新虫 (初入文坛)
请问你是怎么把氯霉素抗性基因加到pk18mobsacB

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9楼2018-03-26 11:53:33
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