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圆加leaf

新虫 (小有名气)

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[交流] 逆转录试剂盒和TA克隆试剂盒的区别是什么？

本人准备在大肠杆菌中转入一段基因，以表达某个蛋白使大肠杆菌能生产新的东西。在重组DNA时遇到困惑，想惊叫各位老师
已知这段基因的mRNA 序列，我看了文章后，是这么理解：扩增——凝胶电泳——回收PCR产物——转化到细菌——提质粒——测序，不知这么理解是不是对。我看到常用到两个试剂盒，一个是逆转录试剂盒，一个是TA克隆试剂盒，我想请问这两个试剂盒的差别是什么？用逆转录试剂盒加引物然后去转录机子扩展转录，得到的不就是扩增的吗，为什么还要再用TA克隆克隆，TA克隆试剂盒里是不是就有载体，有感受态细胞？

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1楼 2016-03-24 15:48:35

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菜头Q

铜虫 (初入文坛)

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圆加leaf: 金币+10, 非常感谢！ 2016-04-26 09:18:56

我按照实验进行的思路跟你分享一下我的想法。
1.提取目的基因mRNA，用逆转录试剂盒进行逆转录，此时你得到是和你mRNA等量的cDNA.
2.根据mRNA的序列信息，用primer 5.0设计出特异性扩增引物对（考虑公司合成和到手时间，建议先做这个，最好一次做两组以上）。
3.用设计出来的特异性扩增引物对cDNA模板进行PCR扩增，这一步的步骤是为了扩增目的片段并加上与T载配对的A尾。
4.PCR产物可用PCR纯化试剂盒进行纯化。
5.纯化得到的PCR产物按照TA克隆试剂盒的体系进行连接转化，用PCR的方法筛选得到阳性重组子。
6.扩增阳性菌株，提质粒，送测序。测序结果符合预期的甘油保菌。
PS：逆转录试剂盒的作用是把RNA进行逆转录，得到与之互补的cDNA链。TA克隆试剂盒一般有T载体、感受态和鉴定引物，是为了帮助你在不用酶切的条件下得到阳性重组子，且该方法鉴定起来更简单，无需酶切，只看电泳结果就能一目了然。