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圆加leaf新虫 (小有名气)
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[交流]
逆转录试剂盒和TA克隆试剂盒的区别是什么？
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本人准备在大肠杆菌中转入一段基因，以表达某个蛋白使大肠杆菌能生产新的东西。在重组DNA时遇到困惑，想惊叫各位老师 已知这段基因的mRNA 序列，我看了文章后，是这么理解：扩增——凝胶电泳——回收PCR产物——转化到细菌——提质粒——测序，不知这么理解是不是对。我看到常用到两个试剂盒，一个是逆转录试剂盒，一个是TA克隆试剂盒，我想请问这两个试剂盒的差别是什么？用逆转录试剂盒加引物然后去转录机子扩展转录，得到的不就是扩增的吗，为什么还要再用TA克隆克隆，TA克隆试剂盒里是不是就有载体，有感受态细胞？ |
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
圆加leaf: 金币+10, 非常感谢！ 2016-04-26 09:18:56
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圆加leaf: 金币+10, 非常感谢！ 2016-04-26 09:18:56
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我按照实验进行的思路跟你分享一下我的想法。 1.提取目的基因mRNA，用逆转录试剂盒进行逆转录，此时你得到是和你mRNA等量的cDNA. 2.根据mRNA的序列信息，用primer 5.0设计出特异性扩增引物对（考虑公司合成和到手时间，建议先做这个，最好一次做两组以上）。 3.用设计出来的特异性扩增引物对cDNA模板进行PCR扩增，这一步的步骤是为了扩增目的片段并加上与T载配对的A尾。 4.PCR产物可用PCR纯化试剂盒进行纯化。 5.纯化得到的PCR产物按照TA克隆试剂盒的体系进行连接转化，用PCR的方法筛选得到阳性重组子。 6.扩增阳性菌株，提质粒，送测序。测序结果符合预期的甘油保菌。 PS：逆转录试剂盒的作用是把RNA进行逆转录，得到与之互补的cDNA链。TA克隆试剂盒一般有T载体、感受态和鉴定引物，是为了帮助你在不用酶切的条件下得到阳性重组子，且该方法鉴定起来更简单，无需酶切，只看电泳结果就能一目了然。 |
11楼2016-04-25 21:04:49
2楼2016-03-24 16:02:32
圆加leaf
新虫 (小有名气)
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3楼2016-03-24 16:17:01
sandycool
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
圆加leaf: 金币+3 2016-03-28 11:06:31
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
圆加leaf: 金币+3 2016-03-28 11:06:31
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逆转录只是把RNA反转录成cDNA，TA克隆是克隆的一个方法，把你扩增出来的目的片段切胶，回收，连接到载体，转化进入感受态细胞 发自小木虫Android客户端 |
4楼2016-03-24 21:51:35
