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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 绝对定量PCR
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LY1199

铁虫 (小有名气)

[求助] 绝对定量PCR

目的基因片段长度 在 600多bp
材料是土壤，试剂盒提取土壤DNA，以DNA直接作为模板来做定量（有参考文献）
标准品是质粒梯度稀释而成
引物来自于参考文献中


年前做的时候 体系是 25uL的   模板2   引物2   染料 12.5  补足ddw
结果如图1 2 所示
溶解曲线是很漂亮的单峰，证明引物的特异性非常好
标准曲线  在低倍浓度时候  出现质粒污染    而且ＤＮＡ浓度片段　　导致样品分布在标准曲线以外


年后再做的时候　质粒污染很好控制了
结果如图　３　４　所示
　用的同样的引物　体系20uL的  引物1  模板1   燃料10
结果标准曲线可以了，但是溶解曲线出现问题   样品出现杂峰   请问这个杂峰是不是由于引物特异性不好造成的？？
但是 我前后两次用的  引物是同样的（年后又让生工重新做的引物）  反应条件也没变
请问这到底是什么情况？？头疼 都做快半年 了，请各位大神支支招   


目前只有7 个金币了   大家见谅

绝对定量PCR
1.png


绝对定量PCR-1
2.png


绝对定量PCR-2
3.png


绝对定量PCR-3
4.png
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1楼 2016-03-23 20:35:45
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素黑好好学习

新虫 (初入文坛)
模版有可能降解了，之前可能是加样有污染，重新做就好了

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9楼2016-03-26 18:59:10
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LY1199

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 孔名卓 at 2016-03-26 18:07:42
还有稀释的时候一定要混匀，加样的时候注意污染

嗯  问题找到了  
是ＤＮＡ的问题
多谢了
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10楼2016-03-26 21:49:08
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绿烧小鱼

新虫 (初入文坛)
我做HRM的时候也出现过这个问题，然后各种换试剂没用之后，我重新提了DNA，好了

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2楼2016-03-24 00:02:56
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LY1199

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 绿烧小鱼 at 2016-03-24 00:02:56
我做HRM的时候也出现过这个问题，然后各种换试剂没用之后，我重新提了DNA，好了

那有没有可能   年前做的时候是 标准品质粒将样本DNA污染了  所以出现很标准的单峰？？？？
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3楼2016-03-24 12:33:00
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绿烧小鱼

新虫 (初入文坛)
具体不清楚，我的是在77℃，有你86℃的那种二聚体似的峰。换了新模板就没有了。初步猜测是我操作问题，经常吹打模板，导致模板有断的。你的75℃有峰，83℃有小峰，可能是有污染。你有没有反复冻融 or 吹打取样 ?

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4楼2016-03-24 12:46:37
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绿烧小鱼

新虫 (初入文坛)
打错了，是我77有你83℃那种小峰

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5楼2016-03-24 12:47:32
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LY1199

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 绿烧小鱼 at 2016-03-24 12:46:37
具体不清楚，我的是在77℃，有你86℃的那种二聚体似的峰。换了新模板就没有了。初步猜测是我操作问题，经常吹打模板，导致模板有断的。你的75℃有峰，83℃有小峰，可能是有污染。你有没有反复冻融 or 吹打取样 ?
...

年后做的时候， ＤＮＡ都是新提取的　冻融倒是没有　因为是提取之后直接做的　一直在４度里面放的
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6楼2016-03-25 09:54:58
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孔名卓

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
7楼2016-03-26 18:06:09
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孔名卓

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
8楼2016-03-26 18:07:42
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