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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 引物设计
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yvonne9044

新虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 木小默1212 at 2016-03-21 19:33:17
这样的话引物的特异性和错配几率不久会很高吗？这样能得到我的目的基因么？...

直接在引物上选就行，注意gc含量 退火温度，那个打分什么的六十来分的我都扩增成功过，二聚体，发夹啥的有时候避免不了

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11楼2016-03-21 19:46:18
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施子墨

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 木小默1212 at 2016-03-21 19:30:15
用Prmier5设计的引物错配，发夹结构那些选项都是红色的，这个太危险了！...

红的不一定P不出来～多合成几对试试。

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12楼2016-03-21 21:05:51
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施子墨

金虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 施子墨 at 2016-03-21 21:05:51
红的不一定P不出来～多合成几对试试。
...

自己手调一下引物长度，调整下GC含量

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13楼2016-03-21 21:06:37
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木小默1212

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by yvonne9044 at 2016-03-21 19:46:18
直接在引物上选就行，注意gc含量 退火温度，那个打分什么的六十来分的我都扩增成功过，二聚体，发夹啥的有时候避免不了
...

我就担心一个问题，因为我的CDS区比较长，所以我就想提高引物的特异性，这样的话可以提高成功率，但是引物的那些选项是红的，这个我就不得不考虑了，选项就是评价一对引物的，而且不仅仅是在Primer5上设计的引物是这样，就连Oligo7上和NCBI上都不符合要求，甚至就没有能够设计出符合大小的引物！
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14楼2016-03-21 21:21:34
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木小默1212

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 施子墨 at 2016-03-21 21:05:51
红的不一定P不出来～多合成几对试试。
...

好的，但是全红的话就。。。。
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15楼2016-03-21 21:22:07
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木小默1212

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 施子墨 at 2016-03-21 21:06:37
自己手调一下引物长度，调整下GC含量
...

调整GC含量也想过，但是这样的话引物长度就会过短，影响到了引物的特异性了！
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16楼2016-03-21 21:23:11
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yvonne9044

新虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 木小默1212 at 2016-03-21 21:21:34
我就担心一个问题，因为我的CDS区比较长，所以我就想提高引物的特异性，这样的话可以提高成功率，但是引物的那些选项是红的，这个我就不得不考虑了，选项就是评价一对引物的，而且不仅仅是在Primer5上设计的引物是 ...

我想请问一下你，这是你第一次设计引物么？你知道引物就几毛钱一个碱基吧？多设计几对，没啥的，你要是克隆启动子啥的，可能gc含量都上不去，有些事情没办法，就是得试各种方法

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17楼2016-03-21 21:39:03
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csfsophia

新虫 (初入文坛)
克隆CDS序列的目的是什么呢，构建载体？可以手动设计
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18楼2016-03-21 22:08:50
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Bioexperixgs

新虫 (正式写手)
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8楼: Originally posted by 木小默1212 at 2016-03-21 19:32:00
用了Primer5，Oligo7和NCBI，但都没找到符合要求的引物！怎么直接在序列上选择呢，能否细说一下，谢谢！...

看你用途了。这个方法不适合荧光定量引物，但如果你能确定扩增哪一部分序列的话，也可以用。一般在基因组中超过18个连续相同碱基的片段很少，当然有回文结构，重复序列结构的序列有可能非特异性条带。所以，只要引物超过18bp，再者符合引物设计基本原则，基本上用于普通的扩增是完全没问题的。

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19楼2016-03-21 22:55:54
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Bioexperixgs

新虫 (正式写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by Bioexperixgs at 2016-03-21 22:55:54
看你用途了。这个方法不适合荧光定量引物，但如果你能确定扩增哪一部分序列的话，也可以用。一般在基因组中超过18个连续相同碱基的片段很少，当然有回文结构，重复序列结构的序列有可能非特异性条带。所以，只要引 ...

设计好后放在ncbi里面比对，看看特异性。

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20楼2016-03-21 22:56:38
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