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[求助]
关于质粒构建的疑难问题，求指点！！！！ 已有2人参与
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请教质粒构建前辈~目前我想构建某一基因的表达载体，已从cDNA上成功调取该基因，目标基因的大小是2000bp，想要构建到VR1012（4900bp）这个真核表达载体上，使用PCR方法获得酶切位点然后连入双酶切的载体，PCR后核酸胶验证目标条带大小正确，胶回收，同时酶切载体胶回收，将目的基因的正义链与反义链退火（94℃ 10min, 25℃ 30min），连接载体，TOP10感受态转化后，挑单克隆，鉴定（双酶切以及菌液PCR）发现目标基因变短了！  测序发现基因变成了△975-1431nt缺失，少了456bp，反复了3次以上都是这样，请问各位大牛有人知道这种情况是如何造成的？有什么方法能避免，我用相同的方法构建了另外4个基因都没有这样的问题…… |
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建议你选择酶切之前用DNAMAN这个软件检测一下你的序列里有哪些酶切位点，是不是有已经包括了你要用来做酶切的酶。而且那个软件可以告诉你哪个位置有什么酶切位点，比如1352时有a酶切位点。。 发自小木虫Android客户端 |
12楼2016-05-15 00:04:29
siriusxuan
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2楼2016-03-21 00:02:37
兰兰园丁
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【答案】应助回帖
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-03-21 08:43:48
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-03-21 08:43:48
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最大的可能就是你酶切位点选的不对，基因内部可能还有一个位点，因此导致变短 发自小木虫Android客户端 |
3楼2016-03-21 00:10:09
star013 
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4楼2016-03-21 06:03:40
