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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » Qiagen Ni-NTA Spin Kit 缓冲液选择
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laoyongmin

新虫 (初入文坛)

[求助] Qiagen Ni-NTA Spin Kit 缓冲液选择 已有2人参与

本人目前在做His-tagged蛋白纯化，用于后续酶活测定。用的是Qiagen Ni-NTA Spin Kit，说明书推荐的是磷酸钠缓冲液（非变性条件下），含50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，及不同浓度咪唑，pH8.0。然而，根据已有文献（和我是同样的酶），细菌裂解用的缓冲液是25 mM MOPSO，pH7.2，10 mM MgCl2，10% v/v甘油（原文“Bacterial pellets were resuspended in 3 ml 25 mM 3-(N-morpholino)-2–hydroxypropanesulfonic acid (MOPSO), pH 7.2, 10 mM MgCl2, 10% v/v glycerol, and purified using Ni-NTA spin columns (Qiagen, www.qiagen.com) for His-tagged proteins, according to the manufacturer’s instructions”）。我想用文献的缓冲液，应该往里面加相应浓度的咪唑，（1）还要加300 mM NaCl吗？（说明书“All buffers should have sufficient ionic strength to prevent nonspecific interactions between proteins and the Ni-NTA matrix. The minimum salt concentration during binding and washing steps should be 300 mM NaCl. The maximal concentration is 2 M NaCl”）（2）pH也想维持7.2，一定要8.0吗？（3）如果只需加500 mM咪唑洗脱收集（不加300 mM NaCl，pH维持7.2），收集液可以直接用于酶活测定吗？（4）如果必须加300 mM NaCl，最后必须脱盐，再换成文献缓冲液吗？（这样，这个试剂盒岂不没有快速简单的优势了？）
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1楼 2016-03-17 09:28:54
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Champanzee

新虫 (初入文坛)
楼主，透析脱盐很正常吧，我需要透析去咪唑

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没有做不到只有想不到
2楼2016-03-17 23:30:58
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laoyongmin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Champanzee at 2016-03-17 23:30:58
楼主，透析脱盐很正常吧，我需要透析去咪唑

这样一天完成不了，请问经Ni柱纯化的蛋白可以放4度过夜，第二天脱盐吗？

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3楼2016-03-18 10:05:19
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Champanzee

新虫 (初入文坛)
我做的是重组抗原过Ni柱，过夜对活性没什么影响，你可以做对比实验，方便以后实验安排

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没有做不到只有想不到
4楼2016-03-18 23:03:58
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hc2015

新虫 (小有名气)
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nono2009: 金币-20, 屏蔽内容, 违规存档, 注册商家也只能在广告区发广告，其它区发广告仍属违规 2016-05-05 21:50:31
本帖内容被屏蔽
5楼2016-05-04 11:38:37
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

不溶蛋白的性质不一样，保险期间，建议自己做个验证，祝顺利。
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6楼2016-05-13 16:03:26
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