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laoyongmin新虫 (初入文坛)
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Qiagen Ni-NTA Spin Kit 缓冲液选择 已有2人参与
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| 本人目前在做His-tagged蛋白纯化，用于后续酶活测定。用的是Qiagen Ni-NTA Spin Kit，说明书推荐的是磷酸钠缓冲液（非变性条件下），含50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，及不同浓度咪唑，pH8.0。然而，根据已有文献（和我是同样的酶），细菌裂解用的缓冲液是25 mM MOPSO，pH7.2，10 mM MgCl2，10% v/v甘油（原文“Bacterial pellets were resuspended in 3 ml 25 mM 3-(N-morpholino)-2–hydroxypropanesulfonic acid (MOPSO), pH 7.2, 10 mM MgCl2, 10% v/v glycerol, and purified using Ni-NTA spin columns (Qiagen, www.qiagen.com) for His-tagged proteins, according to the manufacturer’s instructions”）。我想用文献的缓冲液，应该往里面加相应浓度的咪唑，（1）还要加300 mM NaCl吗？（说明书“All buffers should have sufficient ionic strength to prevent nonspecific interactions between proteins and the Ni-NTA matrix. The minimum salt concentration during binding and washing steps should be 300 mM NaCl. The maximal concentration is 2 M NaCl”）（2）pH也想维持7.2，一定要8.0吗？（3）如果只需加500 mM咪唑洗脱收集（不加300 mM NaCl，pH维持7.2），收集液可以直接用于酶活测定吗？（4）如果必须加300 mM NaCl，最后必须脱盐，再换成文献缓冲液吗？（这样，这个试剂盒岂不没有快速简单的优势了？） |
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