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我准备在大肠杆菌中异源表达并纯化Methanosarcina acetivorans中的acetate kinase （基因locus number为MA3606），请问： 1）该基因稀有密码子含量如何？我该使用什么蛋白表达菌株？ 2）选择一种pET载体，使该异源表达的蛋白带上C末端的His tag。 3）设计一个纯化方法，将该蛋白纯化（注明用什么buffer，什么色谱柱，什么流速，柱与柱之间需要进行什么处理，如何检测蛋白等）。 |
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【答案】应助回帖
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蛋白表达系统原核/真核/酵母/哺乳动物系统/原理/操作步骤/FAQ：http://www.detaibio.com/topics/dan-bai-biao-da.html 蛋白不表达，蛋白表达不在上清：http://www.detaibio.com/topics/yuan-he-biao-da-faq.html SDS-PAGE实验原理/步骤/FAQ：http://www.detaibio.com/topics/sds-page-technology.html Western blot原理实验操作FAQ：http://www.detaibio.com/material-western-blot.html |
3楼2016-03-18 16:10:40
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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简单理解一下问题就是：我该如何表达一个蛋白？楼主你没经验吧，应该是没做过，，， 没做过的知道分析稀有密码子含量很不错， 1.稀有密码子含量，你可以自己分析，你不是在大肠杆菌表达系统嘛，大肠杆菌有自己喜欢和不喜欢的密码子网上一查就知道了（就是密码子优化的步骤）除此之外除了优化密码子还有mRNA结构优化，这就你自己搞了不同的公司有不同的技术（应该属于机密了吧）； 2. 你应该用什么表达菌株，一般正常情况下 BL21（DE3）就可以了，当然如有表达的蛋白有毒性或者其他特性就另说了（可以看下这篇文章，http://www.detaibio.com/topics/yuan-he-biao-da-faq.html，看原核表达FAQ那个，7 8M的打开会有点慢，里面说的挺好）； 3. 你是原核表达 pet系列你都可以选择，带上his也很正常有利于纯化吗，亲和纯化哈 4. 纯化方法？你都his了，当然亲和纯化，至于你说的什么流速什么buffer什么色谱柱，这个。。。。这都需要有蛋白纯化工作经验至少一两年以上的才能准确回答你，这些因素就是实验摸索的一个过程，恰恰是最重要的，针对不同的蛋白性质也不一样，所以没有固定答案，你还是好好学习亲和纯化原理，如何大概操作步骤，中间的试剂等等自己摸索，纯化有时候buffer不对，结果都会千差万别的，有时候还包涵体更麻烦，上清就好些了 5.检测蛋白，检测蛋白比较简单，跑SDS-PAGE就可以，你的蛋白大小多大你是知道的，只需要在胶上面看看有没有表达就行，没有表达那就不好办了，原因多种更要摸索，如果表达量低，可以在做Western blot定性一下，看看到底有没有，实在不放心也可以切胶测序吗，，，提供一些资料：祝好运，资料如下： 蛋白表达系统介绍：原核酵母哺乳动物系统/原理/操作步骤/FAQ SDS=PAGR实验原理/操作步骤/相关FAQ Western blot实验原理/操作步骤/相关FAQ 原核表达FAQ包括蛋白不表达，蛋白表达不在上清 蛋白纯化：http://wenku.baidu.com/view/521ff9cec281e53a5902ff27 |
2楼2016-03-18 16:06:49
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nono2009: 金币-20, 屏蔽内容, 违规存档, 注册商家也只能在广告区发广告，其它区发广告仍属违规 2016-05-05 21:50:08
nono2009: 金币-20, 屏蔽内容, 违规存档, 注册商家也只能在广告区发广告，其它区发广告仍属违规 2016-05-05 21:50:08
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4楼2016-05-04 11:43:08
hc-material
专家顾问 (职业作家)
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专家经验: +702 - BioEPI: 1
- 应助: 517 (博士)
- 金币: 462.9
- 散金: 18028
- 红花: 313
- 帖子: 3594
- 在线: 518.8小时
- 虫号: 4027804
- 注册: 2015-08-18
- 性别: GG
- 专业: 核技术及其应用
- 管辖: 生物科学
问题太多了，太宽泛。his taq融合蛋白都用镍螯合高流速琼脂糖凝胶纯化。具体买填料会有说明书。祝顺利。 5楼2016-05-13 15:57:17
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