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for_margaret

新虫 (小有名气)


[交流] Q5高保真酶PCR产物怎么添加A尾

妹子化学本科转生物研究生,小白一个,刚入小木虫,木有存货,全献给大神们了。
我的Forward引物和Reverse引物5'端都是A,用Q5高保真酶进行PCR后需要将产物通过T4链接酶链接到pGEM载体上,请问还需要额外加A尾吗?

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qwbio

新虫 (初入文坛)


★ ★
for_margaret(金币+1): 谢谢参与
for_margaret: 金币+1 2016-03-16 01:50:17
PCR合成的是双链,但加 A 得目的是要一个末端游离的碱基,为了与 T 载体的T碱基粘性末端互补(氢键生成)。加A 也不难。
5楼2016-03-15 23:23:01
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for_margaret

新虫 (小有名气)


引用回帖:
5楼: Originally posted by qwbio at 2016-03-15 23:23:01
PCR合成的是双链,但加 A 得目的是要一个末端游离的碱基,为了与 T 载体的T碱基粘性末端互补(氢键生成)。加A 也不难。

是这个理儿。那我能把dATP和pGEM一起加进反应体系让它们一起玩耍吗?链接酶是T4

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6楼2016-03-16 01:49:57
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wang2568

银虫 (小有名气)



for_margaret(金币+1): 谢谢参与
内容已删除
7楼2016-03-16 10:40:45
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for_margaret

新虫 (小有名气)


引用回帖:
7楼: Originally posted by wang2568 at 2016-03-16 10:40:45
TA克隆,去下载个相关产品说明书做,高保真可能不能加A

高保真为什么不能加A尾呀?我做的高保真是从cDNA克隆DNA产物,不是用高保真酶加A尾呀

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8楼2016-03-16 11:21:06
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wang2568

银虫 (小有名气)



for_margaret(金币+1): 谢谢参与
你那载体用酶切后会产生粘性末端,然后PCR产物直接混合后连接,再转化,如果效率低,可以浓缩后再涂板。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
9楼2016-03-16 13:02:54
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qwbio

新虫 (初入文坛)


★ ★ ★
for_margaret(金币+1): 谢谢参与
for_margaret: 金币+2, 么么哒 2016-03-17 21:52:05
引用回帖:
6楼: Originally posted by for_margaret at 2016-03-16 01:49:57
是这个理儿。那我能把dATP和pGEM一起加进反应体系让它们一起玩耍吗?链接酶是T4
...

加A的简便方法是,高保真的 PCR 产物纯化,加 rTaq Buffer、dNTP mix 和 rTaq DNA 聚合酶,72摄氏度10分钟即可。也就是说,不需要加引物。当然,改用 dATP 的效率更高。
10楼2016-03-17 17:55:59
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for_margaret

新虫 (小有名气)


引用回帖:
10楼: Originally posted by qwbio at 2016-03-17 17:55:59
加A的简便方法是,高保真的 PCR 产物纯化,加 rTaq Buffer、dNTP mix 和 rTaq DNA 聚合酶,72摄氏度10分钟即可。也就是说,不需要加引物。当然,改用 dATP 的效率更高。...

十分感谢。我该怎么给你小金币呢?不会用呀

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11楼2016-03-18 01:51:58
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tzynew2楼
2016-03-15 22:49   回复  
for_margaret(金币+1): 谢谢参与
tzynew3楼
2016-03-15 22:49   回复  
for_margaret(金币+1): 谢谢参与
2016-03-15 23:04   回复  
for_margaret(金币+1): 谢谢参与
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