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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » Q5高保真酶PCR产物怎么添加A尾
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for_margaret

新虫 (小有名气)

[交流] Q5高保真酶PCR产物怎么添加A尾

妹子化学本科转生物研究生，小白一个，刚入小木虫，木有存货，全献给大神们了。
我的Forward引物和Reverse引物5'端都是A，用Q5高保真酶进行PCR后需要将产物通过T4链接酶链接到pGEM载体上，请问还需要额外加A尾吗？

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1楼 2016-03-15 22:37:49
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qwbio

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
for_margaret(金币+1): 谢谢参与
for_margaret: 金币+2, 么么哒 2016-03-17 21:52:05
引用回帖:
6楼: Originally posted by for_margaret at 2016-03-16 01:49:57
是这个理儿。那我能把dATP和pGEM一起加进反应体系让它们一起玩耍吗？链接酶是T4
...

加A的简便方法是，高保真的 PCR 产物纯化，加 rTaq Buffer、dNTP mix 和 rTaq DNA 聚合酶，72摄氏度10分钟即可。也就是说，不需要加引物。当然，改用 dATP 的效率更高。
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10楼2016-03-17 17:55:59
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qwbio

新虫 (初入文坛)
★ ★
for_margaret(金币+1): 谢谢参与
for_margaret: 金币+1 2016-03-16 01:50:17
PCR合成的是双链，但加 A 得目的是要一个末端游离的碱基，为了与 T 载体的T碱基粘性末端互补（氢键生成）。加A 也不难。
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5楼2016-03-15 23:23:01
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for_margaret

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by qwbio at 2016-03-15 23:23:01
PCR合成的是双链，但加 A 得目的是要一个末端游离的碱基，为了与 T 载体的T碱基粘性末端互补（氢键生成）。加A 也不难。

是这个理儿。那我能把dATP和pGEM一起加进反应体系让它们一起玩耍吗？链接酶是T4

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6楼2016-03-16 01:49:57
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for_margaret

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by wang2568 at 2016-03-16 10:40:45
TA克隆，去下载个相关产品说明书做，高保真可能不能加A

高保真为什么不能加A尾呀？我做的高保真是从cDNA克隆DNA产物，不是用高保真酶加A尾呀

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8楼2016-03-16 11:21:06
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