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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 内源性控制是什么意思 最后用GAPDH强度对cDNA校正又是什么原理啊？
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辰一笑奈何

新虫 (小有名气)

[求助] 内源性控制是什么意思 最后用GAPDH强度对cDNA校正又是什么原理啊？ 已有1人参与

用试剂盒(Invitrogen, USA)提取RNA并用分光光度计来测量所有RNA的浓度。RNA与低聚糖引物逆转录之后得到单链cDNA，使用DNA聚合酶和两步逆转录PCR的缓冲使其被放大。磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）被用来当做内源性控制。乙酰肝素酶引物：正向引物5’-TTCGATCCCAAGAAGGAATCAAC-3’,反向引物5’-GTAGTGATGC2CATGTAA CTGAATC-3’，扩增片段长度为585 bp。GAPDH引物：正向引物5’-GTCTTCACCACCATGGAGAAGGCT-3’，反向引物 5’-CATGCCAGTGAGCTTCCCGT TCA-3’，扩增片段长度为392 bp。cDNA可以在预变性的PCR热控制器中被扩大，条件为在95 ℃下3分钟，紧接着以95 ℃ 下 30 s, 55 ℃ 下30 s和72 ℃ 下45 s为一个周期，共做30个循环，最后在72 ℃下10分钟扩展。使用GAPDH强度对初始的cDNA总数做校正。最后使用塞恩图像软件使各个波段的强度被量化。重复三次该操作。

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1楼 2016-03-15 20:29:34
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辰一笑奈何

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-15 21:07:28
GAPDH作为内参基因（内源性控制）
该基因为管家（house keeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点等的诱导物质的影响而保持恒定， ...

噢   多谢多谢～

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3楼2016-03-16 08:14:21
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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
GAPDH作为内参基因（内源性控制）
该基因为管家（house keeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提total RNA，poly(A)+ RNA，Western blot等实验操作的标准化的内参
因为GAPDH恒定且表达高，可以通过改变cDNA稀释倍数使扩增后目的条带的亮度（强度量化），进而使其浓度一致。
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2楼2016-03-15 21:07:28
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