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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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辰一笑奈何

新虫 (小有名气)

[求助] 内源性控制是什么意思 最后用GAPDH强度对cDNA校正又是什么原理啊? 已有1人参与

用试剂盒(Invitrogen, USA)提取RNA并用分光光度计来测量所有RNA的浓度。RNA与低聚糖引物逆转录之后得到单链cDNA,使用DNA聚合酶和两步逆转录PCR的缓冲使其被放大。磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)被用来当做内源性控制。乙酰肝素酶引物:正向引物5’-TTCGATCCCAAGAAGGAATCAAC-3’,反向引物5’-GTAGTGATGC2CATGTAA CTGAATC-3’,扩增片段长度为585 bp。GAPDH引物:正向引物5’-GTCTTCACCACCATGGAGAAGGCT-3’,反向引物 5’-CATGCCAGTGAGCTTCCCGT TCA-3’,扩增片段长度为392 bp。cDNA可以在预变性的PCR热控制器中被扩大,条件为在95 ℃下3分钟,紧接着以95 ℃ 下 30 s, 55 ℃ 下30 s和72 ℃ 下45 s为一个周期,共做30个循环,最后在72 ℃下10分钟扩展。使用GAPDH强度对初始的cDNA总数做校正。最后使用塞恩图像软件使各个波段的强度被量化。重复三次该操作。

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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
GAPDH作为内参基因(内源性控制)
该基因为管家(house keeping)基因,几乎在所有组织中都高水平表达,在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的,且不受含有的部分识别位点等的诱导物质的影响而保持恒定,故被广泛用作抽提total RNA,poly(A)+ RNA,Western blot等实验操作的标准化的内参
因为GAPDH恒定且表达高,可以通过改变cDNA稀释倍数使扩增后目的条带的亮度(强度量化),进而使其浓度一致。
2楼2016-03-15 21:07:28
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辰一笑奈何

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-15 21:07:28
GAPDH作为内参基因(内源性控制)
该基因为管家(house keeping)基因,几乎在所有组织中都高水平表达,在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的,且不受含有的部分识别位点等的诱导物质的影响而保持恒定, ...

噢   多谢多谢~

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3楼2016-03-16 08:14:21
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