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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » q-pcr高手来指点一下
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蜂鸟404

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] q-pcr高手来指点一下 已有1人参与

有没有荧光定量高手，请教一个问题，做荧光定量pcr时，我用的内参的表达量和目的基因的表达量差异太大，内参ct值在15以下，目的基因ct值在40左右或者看不到曲线，这时该怎么办，如果不换内参，把内参的模板稀释一定倍数而目的基因模板不稀释可以吗
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1楼 2016-03-14 19:45:33
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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
目的基因Ct值在40以上基本上可信度就很低了，要么是引物结合不好，要么是基因表达量低。通常这样需要重新设计引物（引物非保守区，无发卡，互补尽可能少，特别是3端），或者精细取材找到表达高点的地方提取RNA。另外内参和目的基因的模板是同一个，这样做定量才会有可比性。



如果以上还是不能解决，而有需要表达量的数据，退而取其次做半定量吧。
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2楼2016-03-14 20:30:43
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蜂鸟404

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-14 20:30:43
目的基因Ct值在40以上基本上可信度就很低了，要么是引物结合不好，要么是基因表达量低。通常这样需要重新设计引物（引物非保守区，无发卡，互补尽可能少，特别是3端），或者精细取材找到表达高点的地方提取RNA。另外 ...

我是做细菌的，内参选择比较少，引物我看了没有问题，而且我用普通pcr扩了，特异性很强，我现在怀疑是不是没有表达或者表达量太低，我准备用cdna模版扩增一次普通pcr 跑个胶看看，有没有带

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3楼2016-03-14 20:43:56
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卡维斯

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 蜂鸟404 at 2016-03-14 20:43:56
我是做细菌的，内参选择比较少，引物我看了没有问题，而且我用普通pcr扩了，特异性很强，我现在怀疑是不是没有表达或者表达量太低，我准备用cdna模版扩增一次普通pcr 跑个胶看看，有没有带
...

表达低可能比较大。
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4楼2016-03-14 21:36:26
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G号糖

木虫 (正式写手)
请问楼主最后解决该问题了吗?我最近也在做呢，内参ct值16.目的基因25左右，该怎么稀释哟
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5楼2016-05-24 14:47:14
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蜂鸟404

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by G号糖 at 2016-05-24 14:47:14
请问楼主最后解决该问题了吗?我最近也在做呢，内参ct值16.目的基因25左右，该怎么稀释哟

我那个没解决，不过你这个可以呀，ct值在15到30就可以你的符合要求

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6楼2016-05-24 19:12:11
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G号糖

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 蜂鸟404 at 2016-05-24 19:12:11
我那个没解决，不过你这个可以呀，ct值在15到30就可以你的符合要求
...

是吗？那怎么我的同学都说要在25到30之间才可以

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7楼2016-05-25 08:01:47
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45racegirl

新虫 (初入文坛)
楼主，想问一下，我最近在做荧光定量，我做普通pcr的内参基因产物有500bp左右，在做荧光定量时内参基因就跑不出来，是不是内参基因的问题？

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8楼2017-10-31 17:01:33
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