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aixiachun铜虫 (小有名气)
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[求助]
酿酒酵母感受态转化质粒和片段效率都很低，只长几个，跪求大神们帮忙 已有2人参与
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我利用酿酒酵母同源重组机制，把有同源臂的片段和线性载体导入酿酒酵母感受态，想获得重组质粒，但是感受态效率一致很低，正对照转化的质粒最好的时候也才长了10的3次方（转化DNA约一共有1.2ug），实在是没有办法了，求大神们帮帮忙 我的实验方法： 1.挑单菌落到5mLYPD, 培养约14h。 2.然后以1:50转接到100mLYPD，30度，200rpm培养约6h至OD600=0.8. 3.菌体在4度4000rpm离心5min，倾去培养基。 4.冰冷无菌水洗涤，4度4000rpm离心5min。 5.冰冷的1M山梨醇洗涤，4度4000rpm离心5min。重复一次。 6.菌体重悬在200uL冰冷的1M山梨醇，每管分装50uL。 7.加入<5uL的DNA，轻弹混匀，然后加入到-20度预冷的电转杯，1.5kv电击，立即加入1mL室温的1M山梨醇，30度，200rpm复壮2h，然后涂布在相应的筛选平板。 请问我实验哪里有问题呢？ 还有，酿酒酵母的感受态效率多高才算好呢？ 谢谢了！  |
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aixiachun
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