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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 酿酒酵母感受态转化质粒和片段效率都很低，只长几个，跪求大神们帮忙
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aixiachun

铜虫 (小有名气)

[求助] 酿酒酵母感受态转化质粒和片段效率都很低，只长几个，跪求大神们帮忙 已有2人参与

我利用酿酒酵母同源重组机制，把有同源臂的片段和线性载体导入酿酒酵母感受态，想获得重组质粒，但是感受态效率一致很低，正对照转化的质粒最好的时候也才长了10的3次方（转化DNA约一共有1.2ug），实在是没有办法了，求大神们帮帮忙
我的实验方法：
1.挑单菌落到5mLYPD, 培养约14h。
2.然后以1:50转接到100mLYPD，30度，200rpm培养约6h至OD600=0.8.
3.菌体在4度4000rpm离心5min，倾去培养基。
4.冰冷无菌水洗涤，4度4000rpm离心5min。
5.冰冷的1M山梨醇洗涤，4度4000rpm离心5min。重复一次。
6.菌体重悬在200uL冰冷的1M山梨醇，每管分装50uL。
7.加入<5uL的DNA，轻弹混匀，然后加入到-20度预冷的电转杯，1.5kv电击，立即加入1mL室温的1M山梨醇，30度，200rpm复壮2h，然后涂布在相应的筛选平板。
请问我实验哪里有问题呢？
还有，酿酒酵母的感受态效率多高才算好呢？
谢谢了！
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1楼 2016-03-13 10:55:22
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aixiachun

铜虫 (小有名气)
为什么我在小木虫的求助都没人回复呢
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2楼2016-03-14 08:20:49
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)
能转化出来就就可以了

发自小木虫Android客户端
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3楼2016-03-14 09:35:21
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aixiachun

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by biosci at 2016-03-14 09:35:21
能转化出来就就可以了

有时候长有时候不长，验证的时候也是错的。如果效率高点，阳性率应该好点，所以想提高效率
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4楼2016-03-14 09:39:44
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hj200456

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你用的是什么质粒呢，是不是构建的同源臂有问题，同源臂有多长？
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5楼2016-03-14 12:00:37
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aixiachun

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hj200456 at 2016-03-14 12:00:37
你用的是什么质粒呢，是不是构建的同源臂有问题，同源臂有多长？

正对照的是环状质粒，其他样品是由同源臂的片段和线性载体。同源臂长度在80bp至190bp之间，带上线性载体只转化了3个片段。您觉得我实验方法有没有什么问题呢？
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6楼2016-03-14 16:26:31
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aixiachun

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hj200456 at 2016-03-14 12:00:37
你用的是什么质粒呢，是不是构建的同源臂有问题，同源臂有多长？

质粒是pESC-URA
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7楼2016-03-14 16:26:59
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瘸腿猎豹

铜虫 (初入文坛)
我之前也是用的山梨醇复壮但是效果不好，还不如直接用YPDA孵育30min效果好呢

发自小木虫IOS客户端
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时间可以改变一切！
8楼2016-05-13 13:19:37
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kingjazz23

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
aixiachun: 金币+2 2016-07-12 18:11:44
孵育完后，你一般取多少ul涂布平板？
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9楼2016-07-12 09:16:14
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aixiachun

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by kingjazz23 at 2016-07-12 09:16:14
孵育完后，你一般取多少ul涂布平板？

全部涂了。效果确实不行，估计我手法有问题。后来就不做了。用醋酸锂法转化了。
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10楼2016-07-12 18:10:41
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