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穆子涵

金虫 (初入文坛)

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[求助] 关于体外转录的一些细节问题，还请做过这方面实验的大神不吝赐教已有1人参与

最近因实验需要，要体外转录获得一段RNA进行相关反应，无奈，之前并未接触过体外反应的相关操作，已进行了数次实验，结果均不理想。特来版上求助有做过相关方面实验的大神们，希望诸位能不吝赐教，万分感激

需要转录的RNA长度较短，全长也才180bp左右，使用的启动子为各类载体上常用的T7启动子（TAATACGACTCACTATAGG），通过高保真PCR，后面直接接上了我的片段，以产物片段作为体外反应的模板，使用的是NEB的T7 RNA聚合酶，模板用量为50uL体系加入了200ng PCR产物片段，100U的RNA聚合酶，NTP浓度为各0.5mM。反应时间为37℃ 2h。后用取产物2.5uL 用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，仅发现有一条条带，经过对照分析，该条带为模板DNA片段。

有如下几个问题，还请大神们能够予以指点：

1. 启动子长度是不是偏短，导致聚合酶无法正常附着于模板DNA上？

2. 反应体系中的模板用量是否偏低？因为参考说明书上的检测实验，50uL反应体系的模板用量一般在1ug左右。

3. 聚合酶的用量是否合适？

4. 反应时间是否充足？参看版上的一个帖子说，片段短于200b时，反应时间需要延长，那么延长多少比较合适？

5. 如果反应完成后想进行聚合酶的失活，是不是高温条件下放置数分钟即可？

麻烦诸位大神指点一二，在此先行谢过。

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