| 查看: 4204 | 回复: 2 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
穆子涵金虫 (初入文坛)
|
[求助]
关于体外转录的一些细节问题，还请做过这方面实验的大神不吝赐教 已有1人参与
|
|
|
最近因实验需要，要体外转录获得一段RNA进行相关反应，无奈，之前并未接触过体外反应的相关操作，已进行了数次实验，结果均不理想。特来版上求助有做过相关方面实验的大神们，希望诸位能不吝赐教，万分感激 需要转录的RNA长度较短，全长也才180bp左右，使用的启动子为各类载体上常用的T7启动子（TAATACGACTCACTATAGG），通过高保真PCR，后面直接接上了我的片段，以产物片段作为体外反应的模板，使用的是NEB的T7 RNA聚合酶，模板用量为50uL体系加入了200ng PCR产物片段，100U的RNA聚合酶，NTP浓度为各0.5mM。反应时间为37℃ 2h。后用取产物2.5uL 用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，仅发现有一条条带，经过对照分析，该条带为模板DNA片段。 有如下几个问题，还请大神们能够予以指点： 1. 启动子长度是不是偏短，导致聚合酶无法正常附着于模板DNA上？ 2. 反应体系中的模板用量是否偏低？因为参考说明书上的检测实验，50uL反应体系的模板用量一般在1ug左右。 3. 聚合酶的用量是否合适？ 4. 反应时间是否充足？参看版上的一个帖子说，片段短于200b时，反应时间需要延长，那么延长多少比较合适？ 5. 如果反应完成后想进行聚合酶的失活，是不是高温条件下放置数分钟即可？ 麻烦诸位大神指点一二，在此先行谢过。 |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有63人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
3楼2019-12-16 19:46:12
2楼2017-05-22 13:08:23
