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浅跚潮末

新虫 (初入文坛)

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专业: 蛋白质组学

[求助] 关于体外转录前DNA质粒模板的线性化

最近在做感染性克隆相关的实验，已经构件好了DNA模版，下一步进行体外转录，之后转染细胞，有几个问题不太清楚：

1 在线性化酶切DNA模版链前，DNA模版质粒的浓度要达到多少（微克/微升）转录效果比较好？

2 一般正常体系酶切需要多长时间可以保证质粒充分切割？

3 很多体外转录试剂盒（mMESSAGE mMACHINE® Kit/MEGAscript® Kit）的说明书上介绍，酶切质粒之后需要加入EDTA，醋酸铵和乙醇等试剂来终止酶切，之后离心去上清浓缩质粒再用dH2O或TE buffer，请问做过相关实验的朋友在实验中是否这样处理了呢？

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1楼 2016-03-01 18:05:27

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饿的神啊

新虫 (著名写手)

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性别: MM
专业: 植物病理学

我最近想要体外转录dsRNA，已经在上下游引物的5'端都加了T7启动子序列，但是胶回收得率很低，只有大概40ng/ul，远达不到体外转录试剂盒要求的起始模板量，所以想将PCR产物克隆到带T7启动子的载体上，比如pEASY-T1-simple，现在问题是这类的载体的T7启动子离插入片段都至少有几十bp的距离，我想问这几十bp的非目的片段是否会影响体外转录后生成的dsRNA

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2楼2017-09-15 12:35:16

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