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Misterboy

铁虫 (正式写手)

[求助] overlap PCR已有2人参与

有一个大约10kb的片段，分成两段，用PCR扩增出来了，且两片段之间有25BP的同源臂，现在用overlap PCR一直扩不出目的片段，出现了非特异型扩增，primer用的还是原来的，一个片段的上游引物，一个片段的下游引物，延伸时间增加了一倍，但一直做不出来，各位有为有好一点的建议？
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1楼2019-05-07 21:55:35
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qingai0128

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-05-10 17:53:39
没有细节，怎么判断？ 引起非特异性扩增的原因有很多，Mg2+浓度过高、退火温度太低、引物特异性不好等等原因
至少要把细节贴出来。
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从此以后309了
2楼2019-05-09 10:19:55
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KM石头

金虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-05-10 17:53:52
建议先不加引物，其他正常加，进行10个循环，待温度下降，再加上引物进行30个循环

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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

Misterboy
3楼2019-05-09 22:38:57
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KM石头

金虫 (正式写手)
你可以尝试一下，我都是这样做的，都是成功的

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4楼2019-05-09 22:40:27
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KM石头

金虫 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1 2019-05-30 22:20:57
应该能够起作用，金币

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5楼2019-05-09 22:42:14
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Misterboy

铁虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by KM石头 at 2019-05-09 22:38:57
建议先不加引物，其他正常加，进行10个循环，待温度下降，再加上引物进行30个循环

嗯嗯，感谢，融合大片段，是不是延伸时间也相应的增加了

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6楼2019-05-10 08:26:40
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眺望爱

铜虫 (初入文坛)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2019-05-30 22:21:08
10kb很大了，这个延伸应该要很久吧，你可以把overlap搞长一点啊，比如如果总共两百条编号引物，1-100扩一个，97或者99-200扩一个，这样overlap不就够长了嘛，overlap很重要的，重组还是扩增，短了就没法成功。

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目标：生物的星辰大海！！！！
7楼2019-05-30 16:57:28
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Misterboy

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 眺望爱 at 2019-05-30 16:57:28
10kb很大了，这个延伸应该要很久吧，你可以把overlap搞长一点啊，比如如果总共两百条编号引物，1-100扩一个，97或者99-200扩一个，这样overlap不就够长了嘛，overlap很重要的，重组还是扩增，短了就没法成功。
...

感谢，说的很在理，回头我试试

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8楼2019-05-30 23:42:40
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