【答案】应助回帖

» 收录本帖的淘贴专辑推荐

有价值的生物经验贴

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

1楼2018-02-05 15:42:44

回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zsygxh

金虫 (小有名气)

应助: 4 (幼儿园)
金币: 1109.3
散金: 11
红花: 2
帖子: 105
在线: 56.5小时
虫号: 2821684
注册: 2013-11-23
性别: GG
专业: 生物大分子结构与功能

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
drwhoknowss: 金币+3 2018-02-10 05:19:47

首先，你怎么纯化的，用什么buffer，pH，蛋白等电点等等信息都没有，不好帮你分析。只能笼统地给点建议
1.优化包涵体洗涤，去污剂、低浓度尿素，可以摸一下条件
2.溶解注意完全变性，以及二硫键打开
3.确认使用的是什么镍柱料，NTA、IDA还是其它，优化洗杂咪唑浓度，并将盐浓度提高到300-500，降低非特异性吸附
4.如果纯度不行（其实很正常，镍柱的特异性没那么好，并不是只结合6XHis），那么根据等电点结合离子柱纯化，镍柱低浓度咪唑洗杂后，用无盐Buffer wash一下，再用无盐buffer+250mM咪唑洗脱，洗下样品电导不会很高，可以挂得上离子柱，有条件可以拉个连续梯度，没条件就点梯度慢慢摸，一般没太大问题的

赞一下(2人)

7楼2018-02-07 17:02:46

zsygxh

金虫 (小有名气)

应助: 4 (幼儿园)
金币: 1109.3
散金: 11
红花: 2
帖子: 105
在线: 56.5小时
虫号: 2821684
注册: 2013-11-23
性别: GG
专业: 生物大分子结构与功能

引用回帖:

8楼: Originally posted by 亲爱的不饿 at 2018-02-07 22:08:15
感谢你的建议！这是我之前按这个试剂盒说明做的后来做梯度洗脱只是把洗脱液变了其他都没变

...

这个过于简单化了，这里没给出裂解液的配方，我不知道里面有没有加去污剂，你晃一下裂解液，看它是否容易产生泡沫，如果没有，那这个过程跟本没洗包涵体，只是简单破了菌，你可以在破菌后用buffer加0.5% Triton X-100重悬沉淀，反应十几二十分钟后离心收沉淀，可以根据电泳结果重复几次，后面可以用buffer+低浓度尿素洗，根据电泳结果确定尿素浓度，洗完包涵体纯度一般就比较高了，当然杂带还会有不少，变性溶解时最好加还原剂，打开二硫键，因为你的蛋白形成包涵体错误折叠时有一部分会和杂蛋白错配，形成分子间二硫键（前提你的蛋白含半胱氨酸，否则跳过），不打开二硫键，那些杂蛋白跟目的蛋白就一直分不开，但多数镍柱料不耐受DTT，我用的是QIAGEN的NI-NTA，现在可以耐受10mM DDT了，你的柱料可能不耐受，建议最好使用TCEP，再不济就用B-ME。镍柱纯化主要摸一下洗杂条件。如果纯度还不行，就根据等电点结合离子柱纯化。一般纯化很少说只过一步柱子，纯度就达到目测一条带的效果，通常都是两步以上纯化。另外，建议你一次性多摇几升菌，取部分菌摸一下洗涤包涵体的条件，确定条件后，把剩下的菌洗了，包涵体可以挖到自封袋里压平，冻-80，用的时候，取一点出来，用于后续纯化条件模索

赞一下(2人)

10楼2018-02-07 23:25:27

苏氨酸

新虫 (小有名气)

应助: 2 (幼儿园)
金币: 167.2
帖子: 80
在线: 19.4小时
虫号: 1160897
注册: 2010-12-02
专业: 蛋白质组学

包涵体溶解之前，有没有洗杂？建议用低浓度的尿素2M或4M洗杂

发自小木虫Android客户端

4楼2018-02-05 15:54:39

why9639

木虫 (正式写手)

维斯特洛大陆守门员

应助: 5 (幼儿园)
金币: 1801.4
散金: 29
红花: 2
沙发: 1
帖子: 507
在线: 86.4小时
虫号: 3464020
注册: 2014-10-09
性别: GG
专业: 微生物遗传育种学

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

包涵体的我不太清楚，之前我做过胞外表达的酶，用AKTA蛋白纯化仪基本上可以说就纯化不到纯酶，加样量增加，就能看到杂蛋白条带。若果是有设计组蛋白标签的，用镍柱会得到相对比较纯的酶

十有九人堪白眼，百无一用是书生

6楼2018-02-06 09:09:25

亲爱的不饿

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 40.8
帖子: 13
在线: 12.8小时
虫号: 7833431
注册: 2018-01-26
专业: 兽医传染病学

引用回帖:

7楼: Originally posted by zsygxh at 2018-02-07 17:02:46
首先，你怎么纯化的，用什么buffer，pH，蛋白等电点等等信息都没有，不好帮你分析。只能笼统地给点建议
1.优化包涵体洗涤，去污剂、低浓度尿素，可以摸一下条件
2.溶解注意完全变性，以及二硫键打开
3.确认使用的 ...

感谢你的建议！这是我之前按这个试剂盒说明做的后来做梯度洗脱只是把洗脱液变了其他都没变

发自小木虫IOS客户端

8楼2018-02-07 22:08:15

zsygxh

金虫 (小有名气)

应助: 4 (幼儿园)
金币: 1109.3
散金: 11
红花: 2
帖子: 105
在线: 56.5小时
虫号: 2821684
注册: 2013-11-23
性别: GG
专业: 生物大分子结构与功能

引用回帖:

12楼: Originally posted by 亲爱的不饿 at 2018-02-08 17:47:36
我想再请教你两个问题就是如果这条带是降解带怎么处理呢还有怎么才能鉴别出这是降解带呢？实验室人做纯化很顺利我一做就各种出现问题
...

个人认为这是降解带的可能比较低，蛋白降解多数情况都是蛋白酶作用降解导致，首先你的蛋白表达时错误折叠形成包涵体，蛋白聚集在一起很难被降解，即使能降解也只有占比很少的一小部分，洗完包涵体之后直接变性，溶液中的蛋白酶自然也跟着一起变性。所以通常我们纯化可溶蛋白时为防止降解会加各种蛋白酶抑制剂，而做包涵体时，通常我们都不加蛋白酶抑制剂的。至于鉴别，个人认为不好鉴别，不清楚，除非拿去测序，但纯粹浪费钱。你当它是杂带处理吧，几种纯化方式里除了亲和外，离子柱纯化对你的蛋白是比较适合的。

13楼2018-02-08 22:47:36

普通回帖

亲爱的不饿

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 40.8
帖子: 13
在线: 12.8小时
虫号: 7833431
注册: 2018-01-26
专业: 兽医传染病学

发自小木虫IOS客户端

2楼2018-02-05 15:45:14

亲爱的不饿

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 40.8
帖子: 13
在线: 12.8小时
虫号: 7833431
注册: 2018-01-26
专业: 兽医传染病学

表达量也可以但是一纯化就少

发自小木虫IOS客户端

3楼2018-02-05 15:45:23

亲爱的不饿

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 40.8
帖子: 13
在线: 12.8小时
虫号: 7833431
注册: 2018-01-26
专业: 兽医传染病学

引用回帖:

4楼: Originally posted by 苏氨酸 at 2018-02-05 15:54:39
包涵体溶解之前，有没有洗杂？建议用低浓度的尿素2M或4M洗杂

没有呢但是我低浓度洗脱的时候那条杂蛋白是没有的稍高一点就跟着目的蛋白一起洗下来了我都怀疑是不是目的蛋白降解了

发自小木虫IOS客户端

5楼2018-02-05 22:10:15

亲爱的不饿

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 40.8
帖子: 13
在线: 12.8小时
虫号: 7833431
注册: 2018-01-26
专业: 兽医传染病学

引用回帖:

6楼: Originally posted by why9639 at 2018-02-06 09:09:25
包涵体的我不太清楚，之前我做过胞外表达的酶，用AKTA蛋白纯化仪基本上可以说就纯化不到纯酶，加样量增加，就能看到杂蛋白条带。若果是有设计组蛋白标签的，用镍柱会得到相对比较纯的酶

感谢！我用的就是镍柱纯化的

发自小木虫IOS客户端

9楼2018-02-07 22:09:21