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[求助]
求助 蛋白纯化不出来 每次都有杂带 想哭....已有4人参与
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用的康为世纪包涵体纯化试剂盒。binding buffer 中的咪唑浓度为5mM，洗杂蛋白也是5mM的，这次做了梯度洗脱，10，50，100，150，200，250，300，350，500，如下图图一。另一张图是以前用500mM咪唑洗脱的 ，梯度洗脱也洗不到纯的 好想哭，做了两个月的纯化了  @biostar2009 @飞约疯人院 @youlinglyw 发自小木虫IOS客户端 |
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zsygxh
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【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
drwhoknowss: 金币+3 2018-02-10 05:19:47
感谢参与，应助指数 +1
drwhoknowss: 金币+3 2018-02-10 05:19:47
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首先，你怎么纯化的，用什么buffer，pH，蛋白等电点等等信息都没有，不好帮你分析。只能笼统地给点建议 1.优化包涵体洗涤，去污剂、低浓度尿素，可以摸一下条件 2.溶解注意完全变性，以及二硫键打开 3.确认使用的是什么镍柱料，NTA、IDA还是其它，优化洗杂咪唑浓度，并将盐浓度提高到300-500，降低非特异性吸附 4.如果纯度不行（其实很正常，镍柱的特异性没那么好，并不是只结合6XHis），那么根据等电点结合离子柱纯化，镍柱低浓度咪唑洗杂后，用无盐Buffer wash一下，再用无盐buffer+250mM咪唑洗脱，洗下样品电导不会很高，可以挂得上离子柱，有条件可以拉个连续梯度，没条件就点梯度慢慢摸，一般没太大问题的 |
7楼2018-02-07 17:02:46
2楼2018-02-05 15:45:14
3楼2018-02-05 15:45:23
4楼2018-02-05 15:54:39
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