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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆转化，转化子就是不含目的基因。
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林默泪

新虫 (初入文坛)

[求助] 克隆转化，转化子就是不含目的基因。

我的目的基因是750bp，质粒载体是PET-24a。
我从我师兄的菌提取质粒，然后用KOD酶PCR目的基因。
然后两步酶切质粒和目的基因。NdeI酶切，胶回收，再BamHI酶切，再回收。酶切时间是3个小时以上。
提质粒、PCR、回收后都有电泳检测，条带位置正确。
然后用东洋纺的高效链接液链接目的基因和质粒的酶切片段。连接时间大概时2个小时以上。
转化到感受态细胞JM109，热击法。
然后培养在含Kan+的平板上。
第一次没有长，第二次4个平板，只有一个平板上长了3个，第三次，4个平板上都有，每个大约3—5个。
PCR检测，都没有P出目的片段。

想请教下各位大神，大概会是什么问题，那些地方需要改进。
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1楼2013-11-04 16:16:11
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-11-05 00:31:43
提提质粒酶切看看


最好用快速内切酶，不用依次酶切，浪费不少时间
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2楼2013-11-04 23:30:40
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machao8405

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感受态的问题？不加抗生素，不热激直接图一个板试试

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2013-11-04 23:33:51
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林默泪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by machao8405 at 2013-11-04 23:33:51
感受态的问题？不加抗生素，不热激直接图一个板试试

这个对照做过，没有问题。
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4楼2013-11-05 13:34:12
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林默泪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by charles08 at 2013-11-04 23:30:40
提提质粒酶切看看


最好用快速内切酶，不用依次酶切，浪费不少时间

转化子提质粒酶切吗？
什么是快速内切酶？
因为买的酶不是一家公司的，没办法用通用buffer双酶切。
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5楼2013-11-05 13:35:59
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 林默泪 at 2013-11-05 13:35:59
转化子提质粒酶切吗？
什么是快速内切酶？
因为买的酶不是一家公司的，没办法用通用buffer双酶切。...

用FERMENTAS的快切酶，否则你没多少时间耗的
但是我也是一样
经常出现长斑但不含有重组子的情况
而且斑长得特别好看
如果是载体自连应该也没这么多的
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6楼2013-11-05 16:29:35
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kennyhas

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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林默泪: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-11-06 19:24:07
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-01-27 19:51:56
我的目的基因是750bp，质粒载体是PET-24a。
我从我师兄的菌提取质粒，然后用KOD酶PCR目的基因。
然后两步酶切质粒和目的基因。NdeI酶切，胶回收，再BamHI酶切，再回收。酶切时间是3个小时以上。
提质粒、PCR、回收后都有电泳检测，条带位置正确。
然后用东洋纺的高效链接液链接目的基因和质粒的酶切片段。连接时间大概时2个小时以上。
转化到感受态细胞JM109，热击法。
然后培养在含Kan+的平板上。
第一次没有长，第二次4个平板，只有一个平板上长了3个，第三次，4个平板上都有，每个大约3—5个。
PCR检测，都没有P出目的片段

从你描述来看,pET载体应该是双酶切完全了.(但是一般情况下要注意 载体上两个酶切位点之间的片段有多长?胶回收的时候有没有看到切出来的片段? 如果载体没切干净,那可能会长出很多载体自连的假克隆.)
你的问题很可能出在PCR产物的酶切. 首先,你的引物5'端加了保护碱基吗?如果没有,酶切会变得相对困难.
第二,BamHI 不太好切, 而且你的酶切时间是3小时左右,所以很可能PCR产物上的BamHI没切动或者效率很低.
有一个麻烦点的办法是,你先把PCR产物连接到T-载体上,(如果没有T-载体,随便找个载体,,酶切,补平然后去磷,PCR产物加磷,用平末端连接),然后再从T-载体上把你的目的基因用NdeI和BamHI 切下来,这样做你就能确定目的基因的两端肯定是切开了的. 如果还长不出克隆,那就不是酶切,连接的问题了(当然,你要确定你的感受态细胞是正常的)
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7楼2013-11-06 17:24:24
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liaohongbin

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-01-27 19:52:05
你是目的基因不酶切，直接同源连接的那种吗？这种一般需要在连接和转化的时候设置对照的，还有设计的同源序列是否正确。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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8楼2013-11-06 17:32:56
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林默泪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by kennyhas at 2013-11-06 17:24:24
我的目的基因是750bp，质粒载体是PET-24a。
我从我师兄的菌提取质粒，然后用KOD酶PCR目的基因。
然后两步酶切质粒和目的基因。NdeI酶切，胶回收，再BamHI酶切，再回收。酶切时间是3个小时以上。
提质粒、PCR、回 ...

恩，一般其实我第二步BamHI酶切都是过夜切的。
引物设计是带上保护碱基的。
两个酶切位点之间大概只有40bp的碱基，所以其实我也不是很确定。
我下次有时间再试试TA克隆。
非常感谢你的解答。
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9楼2013-11-06 19:14:08
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林默泪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by liaohongbin at 2013-11-06 17:32:56
你是目的基因不酶切，直接同源连接的那种吗？这种一般需要在连接和转化的时候设置对照的，还有设计的同源序列是否正确。

切的，谢谢。
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10楼2013-11-06 19:24:40
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