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霜落雪

铁虫 (初入文坛)

[求助] pET-30a原核蛋白表达疑问 已有1人参与

新手刚做原核蛋白表达，有许多不明白的地方请教。
1.pET-30a上本身带有两个组氨酸标签，我以后纯化蛋白时要用到组氨酸标签。但是不知道是两个组氨酸标签都留着好还是只留一个好，要是只留一个留哪个呢？还是说根据蛋白大小决定？看到很多前辈说到纯化时挂不上柱子，是不是就和这里组氨酸标签的选择有关系呢？
2.看到一些帖子说到以后还要去除组氨酸标签，为什么呢？
2.是否需要自己添加终止子？
3.蛋白的大小控制在多大合适呢？最终是打算让蛋白入核的。
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1楼 2016-02-25 08:41:27
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wxj2901

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
霜落雪: 金币+5, ★★★很有帮助 2016-02-25 13:05:54
个人理解如下：
1.pET-30a上本身带有两个组氨酸标签，我以后纯化蛋白时要用到组氨酸标签。但是不知道是两个组氨酸标签都留着好还是只留一个好，要是只留一个留哪个呢？还是说根据蛋白大小决定？看到很多前辈说到纯化时挂不上柱子，是不是就和这里组氨酸标签的选择有关系呢？
看蛋白构象，哪端暴露在外面就留哪端的标签。如果要留C端的标签（记得是从N端开始表达），那么自己基因的终止子就要去掉，要不标签就不表达了。
2.看到一些帖子说到以后还要去除组氨酸标签，为什么呢？
这个主要看表达后做什么用吧，有的带有酶切位点还能切掉，没有的话，不好去除吧。
2.是否需要自己添加终止子？
把目的基因插入到多克隆位点，用自己基因的终止子，或把自己的终止子去掉用载体上的。
3.蛋白的大小控制在多大合适呢？最终是打算让蛋白入核的。
这个不清楚，你表达的蛋白还能控制吗，还是可以只表达某个结构域。

建议所有问题都考虑清楚，理解原理后再开始试验，要不可能会返工的。
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2楼2016-02-25 12:16:20
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